[发明专利]一种测定环境样品中痕量沙丁胺醇的方法

权利要求书

1.一种测定环境样品中痕量沙丁胺醇的方法，其特征在于包括以下步骤：

1.材料与试剂：

95％纯度的SAL沙丁胺醇，牛血清白蛋白BSA，卵清蛋白OVA，亲和纯化山羊抗兔抗体，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺TMB、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯TWEN-20，异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕DTTA-Eu³⁺；

缓冲溶液：阻隔缓冲液，磷酸盐缓冲液PBS，0.01mol/L，pH＝7.4；包衣缓冲液，碳酸盐缓冲液CBS，0.05mol/L，pH＝9.6；Tris-HCl缓冲液TBS，0.05mol/L，pH＝7.8，含0.01％氯化钠；PBS，含0.05％吐温-20PBST；TMB溶液，含0.4mmol/L，TMB，柠檬酸缓冲液中含3mmol/L H2O2，pH＝5.0；增强液0.1mol/L，含15μmol/Lβ-萘三氟丙酮和0.1％Triton X-100的双邻苯二甲酸钾缓冲液，pH＝3.2；土样提取液9mL0.2mol/LHCl甲醇，v:v，1:4；1mL乙酸铅饱和溶液；

仪器：免疫微孔洗板机，96孔，并使用M200时间分辨荧光测定仪测量荧光，离心机离心，使用配有Orbitrap MS的ACQUITYUPLC系统检测TRFIA；Eu³⁺标记抗体的制备：

制备Eu3+标记的山羊抗兔抗体，将0.25mg山羊抗兔抗体和0.1mg DTTA-Eu³⁺分别溶解于0.1mL CBS缓冲液0.05mol/L，pH＝8.5中，然后将两种溶液混合，在4℃下搅拌24小时，用TBS透析72h，每8h更换一次，检测透析液的荧光信号，确保透析完成，透析后，在Eu³⁺标记抗体中加入等量的甘油和0.1％的BSA，并在-20℃下保存；

2.TRFIA方法步骤：

在CBS中用涂层抗原100uL/孔覆盖微孔板并孵育2h，用PBST清洗微孔板，然后用1％的OVA在TBS，每孔200uL中培养0.5小时，以阻断微孔板，再经过一个洗涤步骤，加入10％甲醇、0.2mol/LNa⁺和pH＝7.5的样品或标准溶液和PBS稀释的多克隆抗体，50uL/孔，含钠离子和pH值的PBS，将微孔板孵育0.5小时，再次洗涤，加入在PBS中稀释的Eu³⁺标记抗体，100uL/孔，孵育1h，所有孵育在37℃进行，每个洗涤步骤重复5次，再次清洗微孔板后，添加增强溶液200uL/孔，机械振荡8min后，用微量滴定仪在340nm激发波长、615nm发射波长、延迟时间100μs、400μs窗口时间下测定荧光强度。