[发明专利]一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法

说明书

一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法，制备方法为：（1）获得负载有抗原的纳米颗粒，纳米颗粒可以是氧化硅、PLGA、聚苯乙烯球、磁性四氧化三铁等，不同的纳米颗粒，抗原的负载方法不同；（2）将负载抗原的纳米颗粒分散到NaCO3水溶液中，将佐剂溶解到CaCl2水溶液中，将二者混合，离心，洗涤，得到同时包载有抗原和佐剂的微米颗粒疫苗载体。该载体中同时包载有抗原和佐剂，且抗原和佐剂分布于载体的不同位置。本发明制备过程在室温水相下进行，条件温和，保证了抗原和佐剂的活性及载体使用安全性；原料廉价易得，制备工艺简单，抗原负载量高。

技术领域

本发明涉及一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法，属于生物医药及纳微材料制备领域。

背景技术

目前，常见的肿瘤抗原多为蛋白质、多肽和DNA等，在使用过程中安全可靠，但其单独使用时免疫原性较弱，且易被酶降解。通常需要连同佐剂（CpG、R848、PolyI:C）使用或者借助其他手段保护疫苗并刺激免疫应答。商售预防型疫苗常用佐剂为铝佐剂，大量研究结果表明铝佐剂对肿瘤抗原无效。因此，急需开发新型的疫苗载体同时实现佐剂和肿瘤抗原的共负载。

肿瘤疫苗的研究存在的问题是在于难于激发细胞免疫，引发细胞免疫反应首先需要外源性抗原发生溶酶体逃逸至胞质中，并与MHC I作用表达于树突状细胞表面。溶酶体呈酸性，一般认为具有pH响应性的载体具有溶酶体逃逸的能力。因此，我们采用具有pH响应性的碳酸钙微米颗粒包裹负载有抗原的纳米颗粒作为载体，碳酸钙实现溶酶体逃逸的功能，将载有抗原的纳米颗粒和佐剂释放出来，佐剂的作用位点是溶酶体酶，肿瘤抗原作用位点是胞质中的MHC I，载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体使得佐剂和抗原分别作用于不同部位，从而更好发挥各自的功能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）制备纳米颗粒；

（2）将纳米颗粒对抗原进行负载，获得负载有抗原的纳米颗粒；

（3）将上述步骤（2）所述负载有抗原的纳米颗粒加入Na₂CO₃水溶液，超声使其分散均匀；将佐剂加入到CaCl₂水溶液中使其充分溶解；将上述两种溶液等体积混合，搅拌之后静置，离心，超纯水洗涤，得到载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体，该微米颗粒疫苗载体同时含有抗原和佐剂。

进一步，所述的纳米颗粒为氧化硅、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、聚苯乙烯球或者磁性四氧化三铁中的一种，所述的纳米颗粒的粒径小于500 nm。

进一步，所述的抗原为蛋白质抗原（OVA）、多肽抗原GPC-3、多肽抗原Trp2、多肽抗原M27或多肽抗原M30中的一种或几种的组合。

进一步，所述的佐剂为TLR激动剂，所述的TLR激动剂为CpG、R848、PolyI:C中的一种或多种。

进一步，步骤（3）所述加入的负载有抗原的纳米颗粒的量为0.5-200 mg；所述Na₂CO₃水溶液的加入量为1-10 mL所述Na₂CO₃水溶液的浓度为0.1-1.0 M；所述佐剂的加入量为0.25-100 mg，所述CaCl₂水溶液的加入量为1-10 mL，所述CaCl₂水溶液的浓度为0.1-1.0 M。

进一步，所述的载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的为直径5±0.5μm。

进一步，对于所述的不同的纳米颗粒的抗原负载方式不同。