[发明专利]程序性死亡配体1分子完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种程序性死亡配体1分子完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型的建立方法，该方法包括如下步骤：通过胰腺转录因子1a驱动的Cre‑loxp系统，在小鼠胰腺上皮组织中表达持续活化的K‑ras^G12D突变，并选择性敲除TGF‑βR2基因，使小鼠在短期内自发形成胰腺癌，同时敲除所有组织细胞中PD‑L1分子，从而获得肿瘤细胞与间质细胞PD‑L1分子均表达阴性的自发胰腺癌小鼠模型。本发明的有益效果为：本发明构建的PD‑L1完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型，其特点为小鼠胰腺组织可自发形成胰腺癌，且胰腺癌细胞与所有间质细胞均不表达PD‑L1分子，该模型可用于研究PD‑L1分子在小鼠胰腺癌发生发展过程，尤其是免疫逃逸机制的活体研究。

技术领域

本发明涉及一种基因工程小鼠模型的构建方法，主要是一种程序性死亡配体1分子完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型的建立方法。

背景技术

胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是最恶性的胰腺肿瘤，确诊后五年生存率往往不足5％，被称为“癌中之王”^[1,2]。Kras^LSL-G12D/+；TGF-βR2^flox/flox；Ptf1a-Cre(KTC)小鼠可以自然进展为侵袭性胰腺癌，且忠实还原人类胰腺癌的临床及组织学特征^[3]。随着全球抗肿瘤免疫治疗的浪潮兴起，以抗PD-L1/PD-1为代表的免疫检查点抑制治疗相继涌现，而该疗法目前在胰腺癌中未得到确切疗效^[4]。为研究不同组织细胞来源的PD-L1在胰腺癌中的作用方式以及胰腺癌对该疗法的抵抗或代偿机制，我们将PD-L1^-/-小鼠通过杂交手段将其基因型引入KTC小鼠得到全身敲除PD-L1的自发胰腺癌基因工程小鼠模型。该小鼠模型有助于研究多种来源的PD-L1分子对胰腺癌的生物学行为、免疫状态的影响，对药物研发也具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种程序性死亡配体1(PD-L1)分子完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型的建立方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。一种程序性死亡配体1分子完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型的建立方法，该方法包括如下步骤：通过胰腺转录因子1a驱动的Cre-loxp系统，在小鼠胰腺上皮组织中表达持续活化的K-ras^G12D突变，并选择性敲除TGF-βR2基因，使小鼠在短期内自发形成胰腺癌，同时敲除所有组织细胞中PD-L1分子，从而获得肿瘤细胞与间质细胞PD-L1分子均表达阴性的自发胰腺癌小鼠模型。

更进一步的，该方法包括如下步骤：

(1)、自美国Jackson Lab购得Kras^LSL-G12D/+、PD-L1^+/-转基因小鼠；经美国Vanderbilt-Ingram癌症中心Harold Moses教授处获赠TGF-βR2^flox/flox，Ptf1a-cre转基因小鼠；

(2)、将上述四种小鼠进行杂交繁殖；

(3)、构建引物，对杂交的小鼠后代进行基因型鉴定，筛选得到Kras^LSL-G12D/+TGF-βR2^flox/floxPD-L1^-/-Ptf1a-Cre小鼠，即KTC-P^KO小鼠。

更进一步的，步骤(3)中子代小鼠分别剪取鼠尾或脚趾，放入EP管中，加入300ul50mMNaOH，金属浴100℃煮1小时，加入30ulpH6.8 TrisHCL中和；12000转/分离心5分钟，上清即为制备好的鼠尾DNA模版液，用于进行后续的PCR鉴定；同时具有Kras突变条带、TGF-βR2LoxP条带、PD-L1KO条带、Ptf1a-Cre条带的即为目的KTC-P^KO小鼠。