[发明专利]程序性死亡配体1分子完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型的建立方法

权利要求书

1.一种程序性死亡配体1分子完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型的建立方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：通过胰腺转录因子1a驱动的Cre-loxp系统，在小鼠胰腺上皮组织中表达持续活化的K-ras^G12D突变，并选择性敲除TGF-βR2基因，使小鼠在短期内自发形成胰腺癌，同时敲除所有组织细胞中PD-L1分子，从而获得肿瘤细胞与间质细胞PD-L1分子均表达阴性的自发胰腺癌小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的程序性死亡配体1分子完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型的建立方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(1)、自美国Jackson Lab购得Kras^LSL-G12D/+、PD-L1^+/-转基因小鼠；经美国Vanderbilt-Ingram癌症中心Harold Moses教授处获赠TGF-βR2^flox/flox，Ptf1a-cre转基因小鼠；

(2)、将上述四种小鼠进行杂交繁殖；

(3)、构建引物，对杂交的小鼠后代进行基因型鉴定；

PCR鉴定小鼠的基因型，引物序列：

TGF-βR2:T004:5’-TAAACA AGGTCCGGAGCCCA-3’,T005:ATATCTGCAAGAGGTCCCCT；LoxP产物条带为540bp，野生型产物条带为420bp；

Kras:oIMR9592:5’-GCAGGTCGAGGGACCTAATA-3’,22908:5’-CTGCATAGTACGCTATACCCGT-3’；突变产物条带为100bp；

Ptf1a-Cre:Cre1:5’-ATA GGCTACCTGGCCATGCCC-3’；Cre2:5’-CGG GCT GCAGGA ATTCGTCG-3’；突变产物条带为210bp；

PD-L1:10685:5’-CTAACAGGTGATCCGTTTCCTATG-3’；10686:5’-GCCGTGATAGTAAACGCTGAA-3’；野生型产物条带约为330bp；oIMR6046:5’-ATT GAA CAA GATGGA TTG CAC-3’；oIMR6047:5’-CGTCCAGATCATCCTGATC-3’；突变型产物条带约为500bp；

筛选得到Kras^LSL-G12D/+TGF-βR2^flox/floxPD-L1^-/-Ptf1a-Cre小鼠，同时具有Kras突变条带、TGF-βR2LoxP条带、PD-L1 KO条带、Ptf1a-Cre条带的即为目的KTC-P^KO小鼠。

3.根据权利要求2所述的程序性死亡配体1分子完全敲除的自发胰腺癌小鼠模型的建立方法，其特征在于：步骤(3)中子代小鼠分别剪取鼠尾或脚趾，放入EP管中，加入300ul50mMNaOH，金属浴100℃煮1小时，加入30ulpH6.8 TrisHCL中和；12000转/分离心5分钟，上清即为制备好的鼠尾DNA模版液，用于进行后续的PCR鉴定。