[发明专利]改进的慢病毒载体

说明书

本发明属于生物医药领域。具体而言，本发明涉及改进的慢病毒载体及其制备方法和用途。具体而言，本发明涉及特别适合于制备治疗性T细胞的慢病毒载体。

技术领域

本发明属于生物医药领域。具体而言，本发明涉及改进的慢病毒载体及其制备方法 和用途。具体而言，本发明涉及特别适合于制备治疗性T细胞的慢病毒载体。

发明背景

T细胞是体内执行肿瘤细胞杀伤和病毒感染细胞杀伤的关键免疫细胞。近年来，使用T细胞，包括来源于体外诱导或肿瘤浸润淋巴细胞的抗原特异性T细胞、基因改造的 嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、基因改造的T细胞受体T细胞(TCR-T细胞)进行恶 性肿瘤的治疗，在部分临床患者中显示了显著的肿瘤清除和控制作用。然而，由于患者 体内肿瘤的免疫逃逸作用，部分肿瘤患者对回输的T细胞产生抵抗作用，导致T细胞不 能发挥应有的抗肿瘤作用。

体内体外的研究均表明，TGF-β是重要的T细胞抑制因子，导致T细胞对靶细胞的杀伤作用减弱或消失。在临床上，TGF-β广泛表达于多种肿瘤组织中，显著抑制肿瘤特 异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，是免疫治疗失败的重要原因。而显性负性TGF-βII 型受体(dominant negative TGF-βreceptor type II,DNRII)是TGF-β的负性调节受体，可以 抑制TGF-β对T细胞的抑制作用。在动物体内，通过给予或者表达T细胞特异性的 DNRII，或者给予可溶性TGF-βRII，干扰TGF-β信号通路，可以显著提高T细胞对肿 瘤的杀伤作用。美国贝勒医学院Catherin M Bollard领导的研究团队发现，给予患者EB 病毒特异性的T细胞(EBV-CTL)治疗，对EBV感染导致的霍杰金和非霍杰金淋巴瘤均 有一定的效果。然而，在这些疾病中，由于肿瘤组织表达TGF-β，EBV-CTL的疗效受 到干扰。该研究团队通过基因转导的方式，将DNRII表达于EBV-CTL细胞表面，用于 治疗复发的霍杰金淋巴瘤。在7名患者可以评价的患者中，4名患者获得了完全缓解， 其中2例患者完全缓解持续4年，其中1例是在未经DNRII基因修饰的EBV-CTL治疗 后未能获得完全缓解的患者。然而，这些EBV-CTL仅仅表达DNRII一种外源蛋白。

在目前应用与临床的CAR-T细胞和TCR-T细胞治疗中，同样面临肿瘤细胞表达TGF-β，导致CAR-T细胞和TCR-T细胞功能受到抑制的问题。本领域也期望将DNRII 导入CAR-T细胞或TCR-T细胞中。然而，迄今为止，尚未有将CAR/TCR与DNRII共 表达于同一T细胞用于治疗肿瘤的报道。这可能由于现有的表达系统对两种蛋白的共表 达效率低，难以满足临床需要。

为了解决该问题，需要新的改进的表达载体，如改进的慢病毒载体，其特别适合于两种或更多种蛋白的高效共表达。

附图简述

图1示出用于表达CAR-19的慢病毒载体结构及完整性鉴定策略。(A)包含P_EF1α-L(长 启动子，531bp)的老载体pPVLV1；(B)包括P_EF1α-S(短启动子，212bp)的新载体pPVLV2。从使用随机六聚体引物逆转录的cDNA产生预期的PCR产物(F1-F5：PCR片段)，鉴定 病毒载体的完整性。

图2示出pPVLV1和pPVLV2的差别。(A)从病毒基因组的逆转录cDNA扩增出预 期的DNA片段。在含有P_EF1α-L的病毒基因片段中观察到缺陷的基因位点。用箭头指示 具有意外大小的DNA片段(左图)。(B)比较表达CAR-19的细胞的百分比和(C)转导293T 细胞48小时后各载体的滴度。

图3示出CAR-19-Fluc的结构和荧光素酶活性。(A)和(B)使用的编码克隆在P2A-Fluc 盒上游的CAR-19的双顺反子构建体。(C)表达的CAR-19和Fluc分子的示意图。(D) 在慢病毒载体转导293T细胞后48小时测定的荧光素酶活性。