[发明专利]检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法

说明书

本发明公开了一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，该方法具体包括以下步骤：(1)以Vp_AHPND的PirA^Vp基因为检测靶基因，设计特异性的引物和TaqMan‑MGB探针；(2)提取Vp_AHPND的DNA，并构建重组质粒，制备标准品，‑20℃保存备用；(3)进行荧光定量PCR反应，建立起始模板拷贝数的对数与阈值循环数之间的标准曲线和标准方程；(4)使用步骤(1)中的引物和探针对待测样品进行检测，将所测得的阈值循环数根据标准曲线即可计算出待测样品中Vp_AHPND的拷贝数。本发明建立的非诊断目的检测Vp_AHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点，可用于临床对虾样品及水样的Vp_AHPND检测。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法。

背景技术

2009年以来，急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND)在全球对虾养殖范围内广泛爆发流行，主要危害凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)和中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)，使得对虾产量大幅下降，给养虾业带来了巨大的经济损失，我国以凡纳滨对虾养殖为主的对虾养殖业也遭受重创。该病因无明显发病症状且死亡前没有明显的前兆，绝大部分对虾死亡于池底，不容易被发现，俗称“偷死病”；由于该病主要发生于虾苗放养后7-30d，所以又称为早期死亡综合征(Early mortality syndrome，EMS)。

研究表明，对虾AHPND的病原是携带含毒力基因PirA^Vp和PirB^Vp的pVA1质粒的致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus,Vp_AHPND)；随后Vp_AHPND中国株及泰国株的基因组序列完成测定并发布，基于PirA^Vp和PirB^Vp基因序列的Vp_AHPND快速检测技术如一步法PCR(AP1、AP2及AP3引物法)、套式PCR(AP4引物法)、荧光定量PCR(TaqMan探针法)和环介导等温扩增法(LAMP)等也相继报道。

但在实际检测工作中，一步法PCR不够敏感，对潜伏感染样品难以检出；套式PCR敏感性高，但需两轮PCR及电泳，操作繁琐、检测时间长；LAMP灵敏、快速，但易出现假阳性；TaqMan探针荧光定量PCR由于探针长度太长，敏感性不佳。

荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光标记物，利用仪器通过荧光强度的检测对PCR扩增产物进行定量，反应和检测都在封闭的管内完成，可克服套式PCR的上述缺点，并以其速度快、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、能定量等优点而被广泛应用于病原体检测。近年来，随着新荧光化学物质的不断开发，TaqMan-MGB探针、TaqMan-LAN探针、Allglo探针等新型探针技术相继涌现，方便了研究工作者在应用荧光定量PCR技术时可依目的基因序列特点以及灵敏度、特异性等方面的不同实验要求选择合适的探针。

而TaqMan-MGB探针是荧光定量PCR使用的TaqMan探针的一种，其在探针的3′端连上不发光的淬灭基团MGB(Minor Groove Binder)结合物，可提高探针Tm值，使高Tm值探针的长度缩短，尤其适合富含AT序列的探针设计；TaqMan-MGB探针原则上只要有一个碱基突变，探针将不会与目的片段杂交，即不产生荧光信号，故特异性更强；此外，MGB探针3′端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，淬灭效果更佳，使杂交的稳定性大大提高、本底小、分辨率更高。