[发明专利]检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)以致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的PirA^Vp基因为检测靶基因，设计特异性的引物和TaqMan-MGB探针，探针的5′端标记荧光基团FAM，3′端标记MGB基团；

(2)提取致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的DNA，并构建重组质粒，测定其浓度后10倍梯度稀释为1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL作标准品，-20℃保存备用；

(3)以步骤(2)中9个梯度的标准品DNA为模板，进行荧光定量PCR反应，建立起始模板拷贝数的对数与阈值循环数之间的标准曲线和标准方程；

(4)先将待测样品进行前处理，然后使用步骤(1)中的引物和探针对待测样品进行检测，将所测得的阈值循环数根据标准曲线即可计算出待测样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物序列为：

上游引物PirA^Vp-qF：5′-CAAACGGAGGCGTCACAGA-3′；

下游引物PirA^Vp-qR：5′-GACCGACTTCCGGGATGAT-3′；

所述探针序列为：

PirA^Vp-P：5′-FAM-AGACAGCAAACATACACC-MGB-3′。

3.根据权利要求1所述的一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(3)中，所述荧光定量PCR反应的20μL反应体系为：Probe qPCR Mix 10μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2μL，上游引物PirA^Vp-qF 1.0μL，下游引物PirA^Vp-qR 1.0μL，探针PirA^Vp-P1.0μL，模板1μL，余量为无核酸酶灭菌ddH₂O。

4.根据权利要求1所述的一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(3)中，所述荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸45s，40个循环，在每次60℃结束时收集荧光信号。

5.一种检测虾样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)将虾样品放入灭菌匀浆管中，加入无核酸酶灭菌ddH₂O，置于匀浆器中匀浆，然后冻融三次，离心，取上清液；

(2)向步骤(1)得到的上清液中加入裂解液，提取总DNA，然后加入洗脱缓冲液溶解DNA；

(3)将步骤(2)得到的DNA按照权利要求1所述检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法进行检测。

6.根据权利要求5所述的一种检测虾样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(1)中，所述无核酸酶灭菌ddH₂O与虾样品的体积质量比为1:1-3；所述离心的温度为4℃，转速为5000-10000r/min，时间为3-10min。

7.根据权利要求5所述的一种检测虾样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(2)中，所述上清液、裂解液和洗脱缓冲液的体积比为2:4:1。