[发明专利]一种利用荧光各向异性技术检测赭曲霉毒素A的方法

说明书

本发明公开了一种利用荧光各向异性技术检测赭曲霉毒素A的方法。本发明选取了可特异性结合赭曲霉毒素A的核酸适配体，将其采用荧光染料标记；针对该核酸适配体设计了与其互补的单链DNA分子，将其采用采用链霉亲和素标记；所述核酸适配体和单链DNA分子结合后，荧光染料和链霉亲和素在空间上邻近；将上述制备的核酸适配体和单链DNA分子和待测样本共同反应，通过测定反应体系的荧光各向异性值实现对待测样本中赭曲霉毒素A的检测。本发明建立的方法具有灵敏、简单、快速、重现性好、易于高通量分析、样品用量少等优点，使用的材料容易制备、合成成本低、稳定性好、储存和运输方便、货架寿命长，具有高灵敏度和良好的选择性。

技术领域

本发明涉及一种利用荧光各向异性技术检测赭曲霉毒素A的方法。

背景技术

赭曲霉毒素A(ochratoxin A，简写为OTA)是由赭曲霉等几种青霉属真菌产生的次级代谢产物，国际癌症研究机构将其列为2B类致癌物。谷物(小麦、玉米等)、粮食、葡萄、咖啡等经常受到OTA的污染。摄入污染了OTA的食品后，对动物和人体的健康造成严重威胁。灵敏、快速检测OTA在食品安全、质量监控、环境分析，特别是现场分析等具有重要的意义和需求。

常用的检测赭曲霉毒素A的方法主要包括色谱法、色谱-质谱联用、质谱法和免疫分析传感等。色谱法、质谱法往往需要昂贵的仪器设备，而且操作繁琐费时。免疫分析需要利用免疫抗体等识别赭曲霉毒素A，免疫分析传感相对来说较为快速，但抗体的制备成本高，抗体的稳定性也不好，容易失活。

核酸适配体(Aptamer)是从寡聚核苷酸文库中筛选得到的能够与靶分子高亲和力和高特异性结合的单链DNA或RNA。在特异性识别功能上，核酸适配体能够与传统的抗体相媲美。同时在生物传感方面，核酸适配体具有一些抗体所不具备的优势。例如，核酸适配体能够通过低成本的化学合成进行大量制备，很容易在核酸适配体上引入各种功能基团。它具有较高的热稳定性，便于长期储存和运输。

相对于其他分析方法如质谱、色谱等，荧光分析技术操作简单，灵敏，仪器成本低，而且检测快速。其中荧光各向异性(荧光偏振)分析方法具有不受荧光强度波动影响、重现性好、信号稳定、易于高通量分析等优势。荧光各向异性和荧光偏振是针对同一物理现象的不同表述，两者在计算公式上有差别，两者可通过适当公式进行相互转换得到。荧光各向异性和荧光偏振两种表达都比较常用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用荧光各向异性技术检测赭曲霉毒素A的方法。

本方法的设计原理如下：荧光染料标记的核酸适配体与链霉亲和素标记的单链DNA分子杂交时，核酸适配体与单链DNA分子反向互补形成双链，链霉亲和素靠近荧光染料分子，由于分子体积增大且荧光染料的局部转动受限，荧光染料标记的适配体产生较高的荧光各向异性(荧光偏振)值。当赭曲霉毒素A时，荧光染料标记的适配体与目标分子结合，不再与链霉亲和素标记的单链DNA分子杂交，此时检测体系呈现较低的荧光各向异性(荧光偏振)信号。根据信号的降低，可以实现对赭曲霉毒素A的检测。

本发明首先提供了一种检测赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：将荧光染料标记的核酸适配体、链霉亲和素标记的单链DNA分子和待测样本共同反应，通过测定反应体系的荧光各向异性(荧光偏振)值实现对待测样本中赭曲霉毒素A的检测；

所述核酸适配体能够特异性结合赭曲霉毒素A；

所述单链DNA分子能够与所述核酸适配体的部分序列反向互补形成双链结构；当形成双链结构后，荧光染料和链霉亲和素位于双链结构的同一端，两者在空间上邻近。

所述方法中，所述“荧光染料和链霉亲和素位于双链结构的同一端，两者在空间上邻近”是通过如下(a1)或(a2)所示的方式实现的：

(a1)当单链DNA分子与核酸适配体的自5’末端起部分序列反向互补时，所述荧光染料标记于核酸适配体的5’末端，所述链霉亲和素标记于单链DNA分子的3’末端；