[发明专利]一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌

说明书

本发明公开了一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌，包括，甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因共表达重组载体的构建；重组基因工程菌的诱导表达；利用所述重组基因工程菌生产胡椒醛。在进行催化时最终能得到15.91g/L、转化率为79.55％，时空转化率为2.27g/L/h的胡椒醛，比现有的胡椒醛产量具有显著提高，因而更有利于顺利实现工业化生产。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌。

背景技术

胡椒醛(Piperonal)又称洋茉莉醛(Heliotropin)，具有清甜的樱桃以及香草的香气。胡椒醛在食用香料、化妆品行业、医药行业、农业以及电镀工业上都有着广泛的应用。天然洋茉莉醛主要存在于甜瓜、刺槐、香胡椒、香荚兰豆等植物中，但含量极少，人们无法从植物中直接提取获得。

目前，洋茉莉醛的工业生产主要是通过以黄樟油素为原料的半合成法和以邻苯二酚为原料的全合成法，该方法环境污染严重，并且耗能较多。随着人们对物质生产过程中的关注及对食品添加物质的要求，生物发酵法及酶法合成的香料物质，越来越受到人们的青睐。

胡椒醛的微生物合成目前并没有应用于工业生产。在巴西Santos团队，发现几株能利用异黄樟素生成胡椒醛的微生物，其中效率最高的菌株为宛氏拟青霉菌，但只有在添加H₂O₂条件下，最高产量为64mg/L，转化率仅为20％。中国专利CN105779363A中发现，一株液化沙雷氏菌能产282mg/L胡椒醛。

因此，如何提高反式茴香脑单加氧酶的酶活性，加快催化其合成胡椒醛的速率是胡椒醛的微生物合成领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中胡椒醛产量和转化率低的不足，提供一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其包括，

甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因共表达重组载体的构建；

重组基因工程菌的诱导表达；

利用所述重组基因工程菌生产胡椒醛；

其中，所述重组载体以pETDuet-1质粒为基础；反式茴香脑单加氧酶基因 tao的核苷酸序列如SEQ IDNO.2；反式茴香脑单加氧酶基因tao突变体基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3；甲酸脱氢酶基因fdh来源于博伊丁假丝酵母 Candida boidinii ，GenBank：AJ011046.2。

作为本发明所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法的一种优选方案：所述甲酸脱氢酶基因fdh与所述反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因以串联的方式连接到pETDuet-1载体，甲酸脱氢酶基因fdh位于pETDuet-1载体的第一个多克隆位点MSC1，所述反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因位于pETDuet-1载体的第二个多克隆位点MSC2。

作为本发明所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法的一种优选方案：所述甲酸脱氢酶基因fdh，经过密码子优化后，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。