[发明专利]一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌

权利要求书

1.一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：包括，

甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因共表达重组载体的构建；

重组基因工程菌的诱导表达；

利用所述重组基因工程菌生产胡椒醛；

其中，所述重组载体以pETDuet-1质粒为基础；反式茴香脑单加氧酶基因tao的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；反式茴香脑单加氧酶基因tao突变体基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3；甲酸脱氢酶基因fdh来源于博伊丁假丝酵母Candida boidinii；

所述甲酸脱氢酶基因fdh，经过密码子优化后，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述利用重组基因工程菌生产胡椒醛，为经过所述重组基因工程菌的诱导表达后，以所述重组基因工程菌为生物催化剂，以黄樟油素为底物，甲酸钠为辅底物，pH 3～9缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～40°C、50～240rpm条件下进行转化0.5～12h。

2.如权利要求1所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述甲酸脱氢酶基因fdh与所述反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因以串联的方式连接到pETDuet-1载体，甲酸脱氢酶基因fdh位于pETDuet-1载体的第一个多克隆位点MSC1，所述反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因位于pETDuet-1载体的第二个多克隆位点MSC2。

3.如权利要求1或2所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述重组基因工程菌来源于E.ColiBL21(DE3)。

4.如权利要求1或2所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述重组基因工程菌的诱导表达，为将甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因共表达重组载体转入E .ColiBL21(DE3)菌株，之后接种于含有30～100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C过夜培养获得种子液；再将种子液以2-5％的接种量接种于含有30～100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37°C培养至OD 600nm为0.5～1 .8，添加终浓度为0.1～1mmol/L IPTG，在16-28°C下诱导培养6～10h，离心，收集菌体细胞。

5.如权利要求1所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述利用重组基因工程菌生产胡椒醛，其反应体系中，所述底物浓度为20g/L，辅底物浓度为40g/L，所述生物催化剂用量以菌体湿重计为10～100g/L。

6.如权利要求1所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述胡椒醛产量15 .91g/L、转化率为79.55％、时空转化率为2.27g/L/h。

7.权利要求1～6中任一项所述的共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶的重组工程菌。