[发明专利]一种半胱氨酸单细胞生物传感器的构建及应用

说明书

本发明公开了一种检测L‑半胱氨酸生物传感器的制备方法，以及在该生物传感器在检测大肠杆菌L‑半胱氨酸产量中的应用。该生物传感器主要元件包括，来源于菠萝泛菌中转录调控基因CcdR编码基因及其启动子区和终止子区、来源于菠萝泛菌中基因ccdA的启动子区、绿色荧光蛋白编码基因eGFP和质粒骨架pTrc‑Mob。该生物传感器可在0～32mmol L^‑1 L‑半胱氨酸浓度下表现良好的线性关系，在0.01～8mmol L^‑1 L‑半胱氨酸浓度下，荧光强度值与半胱氨酸浓度线性关系最高。与高通量筛选体系相结合，利用该生物传感器对大肠杆菌L‑半胱氨酸产量进行实时检测，并能够筛选出L‑半胱氨酸高产突变体，以及L‑半胱氨酸生物合成途径关键酶的突变体。本发明可实现对L‑半胱氨酸的特异性定量实时检测，且灵敏度高。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种L-半胱氨酸生物传感器的构建及其应用。

背景技术

L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于食品，医药以及化妆品行业。因含有还原性极强的巯基，L-半胱氨酸可以将其作为一种天然的还原剂，用于断裂蛋白质当中的二硫键。比如，以其衍生物乙酰L-半胱氨酸为主要成分的祛痰液可以断裂痰当中的二硫键以降低痰的粘性；又如，L-半胱氨酸为主要成分的烫发液可以断裂头发当中的二硫键，所以大量应用于美发行业当中；再如，L-半胱氨酸及其衍生物谷胱甘肽可以断裂酪氨酸酶中的二硫键以使其失活，减少酪氨酸酶产生的黑色素，因而被应用于美容美白产品。以发酵方法生产L-半胱氨酸由于其环境与成本方面的优势被研究者们期望代替传统的水解生产方法。在实验室中，大肠杆菌、菠萝泛菌、谷氨酸棒状杆菌等都被进行代谢改造，作为发酵菌株以生产L-半胱氨酸，其发酵产量可以达到1500mg/L。

已报到的L-半胱氨酸检测方法包括化学检测法、生长互补检测法、高效液相色谱法等，但这些方法灵敏度低、专一性不强并无法用于高通量筛选。在发酵生产中，由于培养基成分复杂，容易对L-半胱氨酸的检测产生干扰。目前还未有L-半胱氨酸高产菌株的高通量筛选方法的相关报道，其主要原因是因为已知的检测方法不能与以流式细胞分选为代表的高通量筛选方法相偶联。因此，急需一种实时、准确、灵敏的L-半胱氨酸检测方法。

本发明基于转录调控因子CcdR，将L-半胱氨酸浓度与荧光强度相偶联，构建了可检测L-半胱氨酸浓度的生物传感器，可实现对L-半胱氨酸的特异性定量检测。

发明内容

针对目前缺乏快速、灵敏且高特异性检测L-半胱氨酸的方法的问题，本发明提供了一种基于转录调控因子CcdR的单细胞L-半胱氨酸生物传感器及其构建方法，该生物传感器可以将L-半胱氨酸浓度转化为荧光强度信号，具有很高的灵敏度。

所述L-半胱氨酸单细胞生物传感器由来源菠萝泛菌中转录调控因子CcdR编码基因及其启动子区和终止子区、来源菠萝泛菌中基因ccdA的启动子区、绿色荧光蛋白编码基因eGFP和质粒骨架pTRCmob质粒组成。通过基因融合的方法将各组成区进行组装，获得质粒pCcdRAe。

所述的单细胞生物传感器检测L-半胱氨酸浓度包括以下步骤：

(1)在37℃的温度下对含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌进行预培养12小时以上直至进入稳定期；

(2)将预培养的大肠杆菌以1:50的接种量接种到新鲜的培养基中；

(3)菌液OD₆₀₀至0.5时加入L-半胱氨酸溶液，2小时后测定荧光强度。

本发明的另一个目的是提供一种能与高通量筛选体系相结合的L-半胱氨酸检测手段，并且证明该方法可以应用于L-半胱氨酸高产菌株和L-半胱氨酸生物合成相关酶的筛选当中，以获得L-半胱氨酸产量菌株。

所述L-半胱氨酸单细胞生物传感器高通量筛选L-半胱氨酸高产菌株包括以下步骤：