[发明专利]一种半胱氨酸单细胞生物传感器的构建及应用

权利要求书

1.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器，其特征在于：包括转录调控因子CcdR编码基因及其启动子区和终止子区、基因ccdA启动子区、绿色荧光蛋白编码基因eGFP和质粒骨架。

2.根据权利要求1所述的L-半胱氨酸单细胞生物传感器，其特征在于：所述转录调控因子CcdR编码基因及其启动子区和终止子区来源于菠萝泛菌；基因ccdA的启动子区来源于菠萝泛菌；绿色荧光蛋白编码基因eGFP序列为NCBI数据库标准序列。

3.根据权利要求1～3所述的L-半胱氨酸单细胞生物传感器质粒骨架，其特征在于：能在宿主菌中表达目的基因，所述宿主菌为大肠杆菌或棒杆菌，优选骨架为pTRCmob表达质粒。

4.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器的构建方法，包括以下步骤：将CcdR编码基因及其启动子区和终止子区核苷酸片段、ccdA的启动子区核苷酸片段和绿色荧光蛋白编码基因eGFP整合至pTRCmob表达质粒中，获得响应L-半胱氨酸的表达质粒pCcdRAe。

5.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器在L-半胱氨酸产物检测中的应用，包括以下步骤：

1)将含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌于LB液体培养基中培养至稳定期；

2)以1:50(v/v)的接种量转接种到新鲜的LB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.5～0.8时加入终浓度为0～50mmol/L L-半胱氨酸溶液，2小时后测定荧光强度，其中激发波长为488nm，发射波长为510nm。

6.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器在筛选L-半胱氨酸高产菌株的应用，包括以下步骤：

1)将含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌于LB液体培养基中过夜培养；

2)使用生理盐水洗涤菌体并重悬至OD₆₀₀＝1～2，取10μL涂布在1mm贴片上；使用常压室温等离子体诱变仪(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)照射5～20s进行菌体诱变；

3)将诱变后的菌体转接至LB液体培养基中过夜培养，使用流式细胞仪筛选荧光信号明显提升的候选细胞；

4)筛选的单菌落接种至LB培养基中振荡培养10～20h，使用酶标仪或荧光分光光度计测定其荧光强度，并用液相色谱仪检测L-半胱氨酸的浓度，筛选得到L-半胱氨酸高产菌株。

7.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器在高通量筛选L-半胱氨酸生物合成相关基因突变体中的应用，包括以下步骤：

1)使用易错PCR对待筛选基因进行随机突变；

2)构建突变体质粒文库并转化至含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌中获得突变体库；

3)突变体接种于含有培养基的96孔板中，培养10～20h，使用酶标仪测定菌体荧光强度；

4)荧光值高于野生型2倍以上的突变体，进行L-半胱氨酸浓度和酶催化活性检测。