[发明专利]一种系统性红斑狼疮的病情评估系统及其试剂盒

权利要求书

1.一种评估系统性红斑狼疮致病相关的Proteobacteria/Bacteroidetes的比值，其特征在于，所述的P/B比值为计算样品中的肠道变形菌门/拟杆菌门。

2.如权利要求1中的一种系统性红斑狼疮致病相关的P/B的比值，其特征在于，所述的样品为粪便。

3.一种系统性红斑狼疮的活动性的评估方法，其特征在于，所述的评估方法是计算患者的P/B比值，然后将该比值和健康人群参考值比较，根据比较结果对系统性红斑狼疮患者进行评估。

4.如权利要求3所述的评估方法，其特征在于，所述的评估方法包括如下的步骤：

1)提取待测样本粪便中的DNA；

2)利用16S rRNA基因V3-V4区特异性引物通过PCR法对其进行扩增标记和测序；

3)对测序所得测序序列进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU，将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对，获得变形菌门和拟杆菌门微生物物种和表达丰度信息，对表达丰度进行平方根的转换；

4)计算P/B比值；

5)将计算得到的P/B比值与健康人群参考值进行比较，根据比较结果对系统性红斑狼疮患者进行评估。

5.一种系统性红斑狼疮致病相关的P/B比值的检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

第一：样本建库测序

在从粪便样本中提取基因组DNA后，所有的DNA的上样终浓度均标准化为5ng/ul，体积至少是2.5ul，即总质量是12.5ng；

(1)PCR扩增

反应体系为：

微生物基因组DNA5ng/ul 2.5μl；

扩增子PCR正向引物1uM 5μl；

扩增子PCR反向引物1uM 5μl；

2×KAPA Hifi hotstar readymix 12.5μl，总体系25μl；

反应程序为：

95℃3min；

95℃30s，55℃30s，72℃30s，共25个循环；

72℃5min，4℃-∞；

Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测PCR扩增产物约550bp即为合格，进行下一步操作；

(2)PCR纯化

1.室温离心扩增子PCR板1000g，1min,撕去密封膜；

2.涡旋震荡AMPure XP磁珠30s，混匀磁珠，使用多通道移液器在上述PCR扩增产物中每孔加入20ul AMPure XP磁珠，加样后及时更换枪头；

3.用移液器上下轻柔混匀10次，室温静置孵育5min；

4.放于磁力架上静置2min；

PCR板放置在在磁力架，进行以下操作：

5.使用多通道移液器弃去上清，更换枪头；

6.每孔加入200ul新鲜配置的80％乙醇进行清洗；

7.静置30s，最大限度的吸走上清；

8.重复清洗一次，最大限度吸走上清；

9.室温放置，风干10min；

10.从磁力架上移开扩增子PCR板，加入52.5ul Nuclease-free water；

11.上下吹打10次充分混合磁珠，室温孵育2min；

12.将扩增子PCR板放回磁力架上静置2min，吸取50ul上清液加入1块新的96孔PCR板中，更换枪头避免交叉污染；

(3)Index PCR

反应体系为：

DNA 5μl；

Nextera XT Index 1引物(N7XX)5μl；

Nextera XT Index 2引物(S5XX)5μl；

2×KAPA Hifi hotstar readymix 25μl；

Nuclease-free water 10μl总体系50μl；

反应程序为：

95℃3min；

95℃30s，55℃30s，72℃30s，共25个循环；

72℃5min，4℃-∞；

(4)PCR纯化

1.室温下离心上述index PCR板280g，1min,撕去密封膜；

2.涡旋震荡AMPure XP磁珠30s混匀磁珠，使用排枪在上述标记的PCR产物中每孔加入56ul AMPure XP磁珠，注意及时更换枪头；

3.用移液器上下混匀10次，室温静置5min；

4.放在磁力架上静置2min；

5.使用排枪弃去上清；

6.每孔加入200ul新鲜配置的80％乙醇进行清洗；

7.静置30s，最大限度的吸走上清；

8.重复清洗1次，吸走上清；

9.室温放置10min，风干；

10.从磁力架上取出index PCR板，加入27.5ul Nuclease-free water；

11.上下吹打10次充分混合磁珠，室温孵育2min；

12.将index PCR板重新放在磁力架上，吸取25ul上清液加入1块新的96孔PCR板中，更换枪头避免交叉污染；

13.磁珠纯化后，Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测文库大小约630bp即为合格，可进行下一步操作；

(5)文库的定量、标准化和池化

计算文库的浓度，DNA浓度(nM)＝DNA文库的浓度(ng/μl)/[(660g/mol×平均文库大小]×10⁶；

基于上述文库浓度，将其稀释至4nM，然后每个库各取5ul进行池化；

(6)文库变性和Miseq样本上样

1)DNA变性及稀释

①在微量离心管里加入4nM pooled library 5μl和新鲜配置的0.2 N NaOH 5μl；

②充分的混匀，室温离心280g，1min；

③室温孵育5min；

④加入990μl预冷的HT1杂交缓冲液制备20pM变性文库；

⑤取上述120ul20pM变性文库，加入480ul预冷的HT1杂交缓冲液制备4pM上样变性文库，充分混合，置于冰上待用；

2)PhiX文库对照品的变性和稀释

取10nM PhiX library 2μl加入3μl的10mM Tris-HCl,pH8.5制成4nM PhiX library，其余步骤同上述DNA变性和稀释；

3)扩增子文库和PhiX文库对照品的混合

①取上述稀释的PhiX文库对照品30μl和扩增子文库570μl进行混合，然后放在冰上直到下一步操作；

②放在恒温加热仪上96℃加热2min；

③孵育后混匀1-2次后立即进行冰浴5min，待上机测序；

4)测序

利用MiSeq测序仪进行测序并通过MiSeq报告软件对MiSeq测序原始数据进行分析；

第二：数据分析

1)测序序列统计、质控与组装

原始数据保存为fastq格式，使用软件去除接头、低质量序列，比对数据库去除污染序列，对优化序列进行组装；

2)对这些测序序列进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU，将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对，获得变形杆菌和拟杆菌门微生物物种和表达丰度信息，表达丰度进行平方根的转换；

3)计算系统性红斑狼疮疾病相关的肠道P/B比值。