[发明专利]一种促进铁皮石斛提前开花的分子方法

权利要求书

1.一种促进铁皮石斛提前开花的分子方法，其特征在于：以铁皮石斛幼嫩茎段为外植体瞬时表达外源早花基因；包括以下具体步骤：

（1）幼嫩茎段采集及消毒：选取长势良好、均匀，叶片健康的铁皮石斛幼嫩茎段和叶片，自来水冲洗10 min 后备用；在紫外线照射 20 min 灭菌过的超净工作台上，先用75vol%酒精浸泡30s，后用50mL 0.1wt%升汞加1μL吐温80的混合液消毒 8 min，间隔震荡确保外植体与消毒液充分接触，无菌水冲洗6-7次保证去除残留消毒物质，置于无菌水中待用；

（2）预培养：用手术刀将消毒后的幼嫩茎段切成长度为1-1.5 cm带有芽眼的茎段，用镊子轻轻将膜质叶鞘拨去，接种于不定芽诱导培养基上预培养7天；

（3）农杆菌侵染及共培养：取携带有拟南芥早花基因FT的病毒表达载体的GV3101农杆菌菌液，加入终浓度为100 μg/mL Kan、50 μg/mL Rif 和100 μg/mL Spec的液体LB培养基中，28℃、180 rpm培养至OD₆₀₀为0.8~1.0，离心后弃上清，沉淀用pH5.6的MES溶液稀释至OD₆₀₀为0.5~0.8，同时加入终浓度为20 mg/L 的AS，得农杆菌侵染液用于转化；所述拟南芥早花基因FT在NCBI中的Gene ID为: 842859；将步骤（2）预培养的茎段用刀片划伤，再用带有侵染液的棉花棒涂抹伤口部位，遮光培养 3~5天，之后将茎段在终浓度为500 mg/L Cef的无菌水中清洗3~5次后用无菌滤纸吸干表面水分；

（4）不定芽培养：将茎段插入不定芽诱导培养基中培养 3周，每周用终浓度500 mg/LCef的无菌水清洗一次，至观察到在茎段节间处长出新芽， 此时切除已褐化的茎段两端表面，接种于不定芽诱导培养基，继代增殖20~30天，令丛生芽继续生长；

（5）生根培养：选取株高为 2-3 cm，具有 2-3 片真叶的不定芽接种至诱导生根培养基中，培养5~10天看到根系形成；

（6）壮苗生根和炼苗移栽：将生根的不定芽切除原带的茎段，转移至壮苗生根培养基中，培养30~60天，试管苗长至 3 cm 以上；将具有 3-4 片叶，4-5 条根生长良好而且根系发达的试管苗移出组培室，于常温下开盖炼苗，7-10天后移栽至日光温室中；使用长镊子轻柔地将培养基与小苗一起取出，保护根茎部不受伤，随后以清水轻柔洗去附着在根上的培养基，再用 0.2wt%多菌灵浸泡消毒 1h，以防栽培后的石斛苗根腐烂或生霉，在阴凉通风处晾根半天至根发白即移栽至含等质量比营养土、蛭石和树皮的基质中；移栽后最初一周不宜接受强光照，空气湿度保持在 80%~90%，一周后，幼苗旧根开始伸长，空气湿度保持在70%-80%，逐渐增加光照；

（7）植株开花情况观察：移栽后6个月起开始观察统计植株开花情况，每个月统计一次；

所述步骤（2）、（4）中不定芽诱导培养基为：1/2MS+2mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+3g/L卡拉胶，pH 值为 5.4~5.8；

所述步骤（5）中诱导生根培养基为：1/2MS +0.5mg/L NAA+30g/L 蔗糖+3g/L卡拉胶，pH值为 5.4~5.8；

所述步骤（6）中壮苗生根培养基为：1/2MS+1mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA +30g/L 蔗糖+100g/L 香蕉汁+3g/L卡拉胶，pH 值为 5.4~5.8。