[发明专利]一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法

说明书

本发明公开了一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，属于分子生物学技术领域。该方法用叶片作为外植体，外植体经消毒和与培养后直接进行农杆菌侵染转化，相较于获得愈伤组织后再用农杆菌侵染愈伤组织更为节省时间。外植体消毒后的预培养、共培养、选择培养过程使用愈伤组织诱导培养基有助于愈伤组织形成和再分化，且从愈伤组织形成、丛芽分化到丛芽增殖使用同一培养基，省去了组培过程中配置不同培养基的繁琐程序，节约了组培时间、人力和物力。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法。

背景技术

中国是世界上拥有杜鹃花种类最多的国家，中国西南地区是世界公认的杜鹃花的故乡。杜鹃花常用作园林景观植物或园艺盆栽植物，供公共园林环境及室内外色绿化美化，具有极高的观赏价值。目前国内对杜鹃花的研究集中于资源考察、形态学分类、孢粉学、生态与分布及植物化学等领域，分子生物学方面的研究进展缓慢。遗传转化体系的建立对于推动杜鹃花分子生物学的发展意义重大。已报道的杜鹃花遗传转化主要是通过农杆菌介导的遗传转化侵染茎段和通过基因枪法转化叶片。使用茎段作为外植体进行遗传转化时愈伤形成和植株再生效率较低，基因枪法仪器设备要求高且成本较高。

本发明提供一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，提高转化效率，降低转化成本，为杜鹃花的分子生物学研究提供便利。

发明内容

本发明针对现有杜鹃花遗传转化效率低、成本高的问题，提供一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法。该方法用叶片作为外植体，外植体经消毒和与培养后直接进行农杆菌侵染转化，相较于获得愈伤组织后再用农杆菌侵染愈伤组织更为节省时间。外植体消毒后的预培养、共培养、选择培养过程使用愈伤组织诱导培养基有助于愈伤组织形成和再分化，且从愈伤组织形成、丛芽分化到丛芽增殖使用同一培养基，省去了组培过程中配置不同培养基的繁琐程序，节约了组培时间、人力和物力。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，于以杜鹃花叶片作为外植体，将已消毒的叶片切成小块置于愈伤诱导培养基上预培养后，取出叶片进行农杆菌侵染，之后再进行共培养、选择培养和继代选择培养，经生根培养后进行移栽和转基因植株的鉴定。

一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，包括以下步骤：叶片采集及消毒、预培养、农杆菌侵染、共培养、选择培养、继代选择培养、生根培养及移栽、转基因植株鉴定。

一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，包括以下具体步骤：

（1）叶片采集与消毒：取杜鹃花幼嫩且带有叶片的枝条，自来水冲洗30～50 min，用滤纸将表面水滴吸干后装入烧杯，在超净工作台中用75vol%的酒精消毒45 s，无菌水清洗两遍；在100 mL 0.1wt%的升汞(HgC1₂)中浸泡6～8 min，用无菌水清洗5～6遍后浸入于无菌水中，将叶片在无菌水中切成0.5 cm × 0.5 cm方块，之后在叶片中部划2-3道切口。

（2）预培养：将步骤（1）切好的叶片叶面在上接种于愈伤组织诱导培养基上，4℃暗培养2～3 天。

（3）农杆菌侵染：取携带有表达载体的GV3101农杆菌菌液，按1vol％～2vol％的比例加入含终浓度为100 μg/ml Kan、50 μg/ml Rif 和100 μg/ml Spec的液体LB培养基里，28℃、180 rpm培养至OD₆₀₀为0.8，将菌液转入50 mL无菌离心管中，于室温条件下，4000 rpm离心5 min，去上清，菌体用pH5.6的BME液体培养基重悬，稀释至OD₆₀₀为0.5~0.8，同时加入终浓度的为20 mg/L 的AS，用于转化，在超净工作台中，取出步骤（2）预培养过的叶片外植体到无菌小培养皿中，倒入备好的重悬菌液，浸泡20 min，用无菌滤纸吸除表面菌液。