[发明专利]一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法

权利要求书

1.一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，其特征在于：所述方法以杜鹃花叶片作为外植体，将已消毒的叶片切成小块置于愈伤诱导培养基上预培养后，取出叶片进行农杆菌侵染，之后再进行共培养、选择培养和继代选择培养，经生根培养后进行移栽和转基因植株的鉴定；

包括以下具体步骤：

（1）叶片采集与消毒：取杜鹃花幼嫩且带有叶片的枝条，自来水冲洗30～50 min，用滤纸将表面水滴吸干后装入烧杯，在超净工作台中用75vol%的酒精消毒45 s，无菌水清洗两遍；在100 mL 0.1wt%的升汞中浸泡6～8 min，用无菌水清洗5～6遍后浸入无菌水中，将叶片在无菌水中切成0.5 cm×0.5 cm方块，之后在叶片中部划2-3道切口；

（2）预培养：将步骤（1）切好的叶片叶面朝上接种于愈伤组织诱导培养基BME+10 mg/LZT+10 mg/L IAA，pH5.6上，4℃暗培养2～3 天；

（3）农杆菌侵染：取携带有表达载体的GV3101农杆菌菌液，按1vol％～2vol％的比例加入含终浓度为100 μg/ml Kan、50 μg/ml Rif 和100 μg/ml Spec的液体LB培养基里，28℃、180 rpm培养至OD₆₀₀为0.8，将菌液转入50 mL无菌离心管中，于室温条件下，4000 rpm离心5min，去上清，菌体用pH5.6的BME液体培养基重悬，稀释至OD₆₀₀为0.5~0.8，同时加入终浓度为20 mg/L 的AS，用于转化，在超净工作台中，取出步骤（2）预培养过的叶片外植体到无菌小培养皿中，倒入备好的重悬菌液，浸泡20 min，用无菌滤纸吸除表面菌液；

（4）共培养：将步骤（3）已侵染过的叶片接种在垫有一层无菌滤纸的叶片愈伤组织诱导培养基BME+10 mg/L ZT+10 mg/L IAA，pH5.6上，25℃暗培养2-3天；

（5）选择培养：将步骤（4）共培养后的叶片用含有终浓度为600 mg/L Cef的无菌水清洗3次，每次5 min，再用无抗生素的灭菌水冲洗两次，用滤纸吸干水，转移到含终浓度为60mg/L Kan的愈伤组织诱导培养基BME+10 mg/L ZT+10 mg/L IAA，pH5.6上，暗培养15天后再光照培养40~50天，此时外植体分化出抗性不定芽且叶片已开始展开，培养温度为25℃；

（6）继代选择培养：将步骤（5）分化出的抗性不定芽转入新的含有终浓度为60 mg/LKan的选择培养基BME+10 mg/L ZT+10 mg/L IAA，pH5.6中进行继代扩繁培养，培养温度为25℃，每30天继代一次，继代2~3次后进行生根培养；

（7）生根培养及移栽：待步骤（6）继代选择培养的不定芽长到2 cm以上时，切下并插入含有终浓度为60 mg/L Kan的生根培养基BME+1 mg/L IAA，pH5.6上进行生根培养，培养温度为25℃，14~20天长出不定根；

（8）转基因植株鉴定：生根培养4~8周后，打开培养瓶盖，炼苗2天后将组培苗移栽至栽培基质中，通过PCR、GUS染色和GFP观察检测转基因是否成功。

2.根据权利要求1所述的一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，其特征在于，步骤（3）中所述的表达载体，携带有GUS基因和GFP基因，以及Kan抗性基因。