[发明专利]一种筛选和/或评价物质的方法及其应用

说明书

一种筛选和/或评价化合物的方法及其应用，所述方法包括以下步骤：(1)对胚胎干细胞进行支持培养；(2)制备细胞球，并在含有待测化合物的分化培养基中进行分化培养得到包含内、中、外三个胚层细胞的腔状拟胚体；(3)通过分析胚胎发育的指标筛选和/或评价所述化合物。本发明可同时进行多种化合物单一或联合暴露的胚胎发育影响的评价，评价指标简单、直观，可对许多新型化合物、新型药物、污染物进行快速的初筛，为后续药理学、毒理学机理提供明确研究方向，且本发明所需供试品用量少，实验周期灵活。

技术领域

本发明属于细胞生物学与环境毒理学交叉领域，涉及一种筛选和/或评价物质的方法，可对不断增长的新化合物、新型污染物、新合成药物、天然提取药物等进行快速筛选与评价。

背景技术

目前评价化合物效应的模型分为两类，分别为体内实验的动物模型和体外实验的细胞模型。对于动物模型，其优点是可以从整体水平评估ADME四相过程(即吸收、分布、代谢、排泄过程)，并能同时对不同脏器的药理学、毒理学作用进行排序分析；缺点是需要大量实验动物，个体差异及物种差别不能忽略，实验重复性较差，对供试的化合物需求量大，因此不适合进行大规模化合物的初步筛查。对于细胞模型，多采用癌细胞系和原代细胞作为实验模型。相比动物模型，这类细胞模型有更好的可重复性，能够在短期时间内进行大规模实验。但是由于实验细胞类型为癌细胞系或原代细胞，并不是生理状态下的健康细胞，同时无法进行胚胎以及器官发育过程的研究，所以很大的限制了研究的广度与深度。

发明内容

有鉴于此，本发明中利用胚胎干细胞相关技术作为支持进行研究，克服了以上困难。首先，胚胎干细胞是正常细胞，相比癌细胞系或原代细胞更接近健康生理环境；其次，胚胎干细胞具有无限增殖与多向分化这两个重要的特征。无限增殖即为在体外无限传代并保持正常状态，这就大大降低了批次不同所产生的误差。多向分化即具有分化为各个器官与组织的潜能，这就意味着在特定条件下，可以模拟不同器官或组织的发育过程，从胚胎干细胞分化为其他前体细胞或成熟细胞类型。由此可见，利用本发明进行化合物的胚胎发育阶段及不同器官早期发育过程的评价，不仅能够在短时间内高效评价大量的化合物，而且能够得到非常接近动物真实情况的实验数据，为后续的机理研究、化合物管控政策制定、新药临床前评估提供非常有力的基础与证据。

本发明的目的是在特定培养条件下，胚胎干细胞(ESC)分化形成拟胚体(EmbryoidBody，EB)并在分化培养基中多向分化，模拟早期胚胎发育。在多向分化过程中，暴露不同化合物或其混合物，对早期胚胎发育的影响进行评价。

为了达到上述目的，一方面，本发明提出一种筛选和/或评价物质的方法，包括以下步骤：

(1)对胚胎干细胞进行支持培养；

(2)制备细胞球，并在含有待测物质的分化培养基中进行分化培养得到包含内、中、外三个胚层细胞的腔状拟胚体；

(3)通过分析胚胎发育的指标筛选和/或评价所述物质。

在一些实施例中，所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞或人胚胎干细胞。

在一些实施例中，所述分化培养基包括：DMEM/F-12培养基、胰岛素、维生素C磷酸酯镁、转铁蛋白、硒酸钠、和DNA酶，优选地，各组分的含量为：胰岛素19.4μg/L、维生素C磷酸酯镁64mg/L、转铁蛋白10.7mg/L、硒酸钠14μg/L和DNA酶1mg/L。

在一些实施例中，所述细胞球的制备方法包括将步骤(1)中得到的胚胎干细胞消化成单细胞悬液，然后在分化培养基中进行单细胞接种。

在一些实施例中，单细胞接种的第一天，使用的分化培养基包括ROCK1抑制剂Y27632。

在一些实施例中，所述分化培养基中Y27632的含量为10μM。