[发明专利]一种对柑橘黄龙病具有抗性或耐性的种质材料的快速鉴定方法

权利要求书

1.一种对柑橘黄龙病具有抗性或耐性的种质材料的快速鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：收集待鉴定的种质材料；

步骤2：选取对步骤1待鉴定的种质材料具有嫁接亲和力且感染黄龙病菌的柑橘树，作为高接树；

步骤3：高接

春接时间为2-4月，高接方式为单芽切接，具体为：在步骤2选取的高接树上，选取直径0.5cm以上的枝条,在树皮平滑处剪断，在枝条断面下方，沿皮层与木质部交界处向下纵切一刀，露出形成层，切面短于接穗芽，然后从步骤1待鉴定的种质材料的枝条上切取单芽,并插入中间砧枝条切口上，对准双方形成层并缚紧；

秋接时间为9-11月，高接方式为小芽腹接，具体为：在步骤2选取的高接树上，选取直径0.5cm以上的枝条，在树皮平滑处沿皮层与木质部交界处向下纵切一刀，露出形成层，切面长度为2cm-4cm,然后从步骤1待鉴定的种质材料的枝条上切取芽片，并插入中间砧枝条切口上并缚紧，保留高接枝条；

步骤4：田间管理

高接树的田间管理与普通柑橘果园管理一致；

步骤5：田间症状观察

在步骤3高接4个月后，根据待鉴定的种质材料抽出的枝梢的症状来进行诊断：枝梢生长良好、无黄梢、无黄叶或仅有轻微叶片黄化症状，则初步判定该种质材料对柑橘黄龙病具有抗性或耐性；枝梢生长较弱、黄梢严重、叶片斑驳型黄化症状明显，则初步判定该种质材料对柑橘黄龙病不具有抗性或耐性；

步骤6：实时荧光定量PCR检测

从高接成活且初步判定为对柑橘黄龙病具有抗性或耐性的种质材料的叶片中，提取DNA，得到待测样品的DNA模板；从健康柑橘树的叶片中，提取DNA，作为阴性对照；从柑橘黄龙病树的叶片中，提取DNA，作为阳性对照；进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线，并建立标准曲线方程，计算出病原菌含量；

步骤7：结果评价

根据步骤6实时荧光定量PCR检测结果并结合步骤5田间症状观察结果，进行效果评价：待测样品中检测不到黄龙病菌且植株田间生长良好、无黄龙病症状，则判定该种质材料对柑橘黄龙病具有抗性；待测样品中能检测到黄龙病菌，但植株田间生长较好，有轻微黄龙病症状，则判定该种质材料对柑橘黄龙病具有耐性。

2.根据权利要求1所述的对柑橘黄龙病具有抗性或耐性的种质材料的快速鉴定方法，其特征在于，步骤1中，所述待鉴定的种质材料为柑橘属、金柑属和枳属中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的对柑橘黄龙病具有抗性或耐性的种质材料的快速鉴定方法，其特征在于，步骤6中，所述提取DNA的方法，均包括如下步骤：

步骤6.1：剥取叶片中脉，置于已灭菌的研钵内，加入液氮,研磨成细粉末；

步骤6.2：取0.05g细粉末置于2mL无菌离心管中，加入1mL含2.5％聚乙烯吡咯烷酮的DNA提取缓冲液，于25℃，14000rpm离心5min，倒掉上清液；

步骤6.3：向离心管中加入1mL DNA提取缓冲液，重新悬浮，涡旋混匀，于25℃，14000rpm离心5min；

步骤6.4：倒掉上清液，加入300μL DNA提取缓冲液，重新悬浮，加入300μL裂解缓冲液和200μL质量百分数为5％的十二烷基肌氨酸钠，涡旋混匀，65℃水浴45min；

步骤6.5：加入800μL体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，涡旋混匀，于25℃，14000rpm离心10min；

步骤6.6：取700μL上清液转移到另一无菌离心管中，加入4mL体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，涡旋混匀，于25℃，14000rpm离心10min；

步骤6.7：取600μL上清液转移到另一无菌离心管中，加入2倍体积的冰冻100％乙醇和1/10体积的醋酸钠，轻轻翻转离心管10次，混匀液体，-20℃下静置至少1h，于4℃，14000rpm离心15min；

步骤6.8：倒掉上清液，加入1mL冰冻70％乙醇，轻轻翻转，于4℃，14000rpm离心5min；

步骤6.9：再次倒掉上清液，加入1mL冰冻70％乙醇，轻轻翻转，于25℃，14000rpm离心5min；

步骤6.10：室温下晾干离心管，加入100μL1×TE缓冲液，4℃过夜，即提取得到DNA。