[发明专利]一种大体积生物样本低温保存的方法

说明书

本发明属于生物医学领域，公开了一种大体积生物样本低温保存的方法，所述方法具体为生物样本经预处理后添加保护剂然后注入聚四氟乙烯管中冷冻保存，待需要时水浴复温。本发明所述低温保存的方法成功的实现了低浓度保护剂作用下的大体积生物样本冻存，是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存生物样本的方法，通过该方法可以获得微结构完整、细胞活力强、生物功能优异的生物样本。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种大体积生物样本低温保存的方法。

背景技术

生物材料的低温保存，是指采用特定的方法将生物材料冷却至低温，并长期保存；待需要时，可将生物材料按特定的方法复温至生理温度，且使其仍然保持足够的活性。随着现代生物医学发展，低温保存的作用日益凸显，尤其是对组织、器官等大体积生物样本的冻存具有重大意义。

典型的低温保存主要包括五个步骤：添加保护剂、降温、长期保存、复温、去除保护剂。在低温保存过程中，生物材料不可避免会遭受各种损伤，其主要引发因素包括：渗透压的改变、冰晶的生长、降温和复温过程中样品内部的温度梯度、复温过程的反玻璃化和再结晶等。因此，低渗透性保护剂浓度以及快速、均匀的降复温过程是实现生物样品成功保存的重要条件。

现有的低温保存诸如血管这样大尺寸生物样品的方案是将样品经处理后放入低温冻存管中，生物样品在冷冻后会蜷缩弯曲，这将对生物样品的结构、力学和生物学特性造成损伤。且现有的保存技术多采用逐步添加保护剂的方法，使用程序化的降温过程，采用恒温水浴中边摇动边被动复温的方式，历时漫长、操作繁琐，这些都严重影响了大体积生物样本的保存效果。

由于低温冻存管的宏观尺寸，以及热量从外向内的传导方式，热量传输的速度有限，生物材料样品内部各个位置在降复温过程中的温度差异较大，样品内外温度梯度较大，这将导致较大的热应力产生，易引发断裂和微裂纹。复温速率不够快，会导致严重的反玻璃化和再结晶，从而严重影响保存的效果和存活率；同时，高浓度的冷冻保护剂可能导致不可控的渗透损伤和生化毒性，这对于生物材料来说是致命的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种大体积生物样本低温保存的方法，适合于细胞、细胞水凝胶构建物和微组织等大体积生物样本的长期高效保存。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种大体积生物样本低温保存的方法，生物样本经预处理后添加保护剂然后注入聚四氟乙烯管中冷冻保存，待需要时水浴复温。

作为优选，在注入聚四氟乙烯管前还添加磁性纳米颗粒，且水浴复温时置于电磁线圈内进行电磁复温。

作为优选，所述预处理为样本获取、核-壳结构的干细胞水凝胶构建物和干细胞水凝胶纤维的生成。

作为优选，所述生物样本为核-壳结构的干细胞水凝胶构建物和干细胞水凝胶纤维时，所述保护剂包括第一保护剂和第二保护剂，第一保护剂为含1mol/L乙二醇和1mol/L1，2-丙二醇的培养基溶液，第二保护剂为含1mol/L～1.5mol/L乙二醇、1.5mol/L1，2-丙二醇、0.002mol/L葡聚糖和0.75mol/L～1mol/L海藻糖的培养基溶液；

所述生物样本为脂肪干细胞时，所述保护剂包括第一保护剂、第二保护剂和第三保护剂，第一保护剂为含1mol/L乙二醇和1mol/L1，2-丙二醇的培养基溶液，第二保护剂为含1.5mol/L乙二醇+1.5mol/L1，2-丙二醇的培养基溶液，第三保护剂为含2mol/L乙二醇、2mol/L1，2-丙二醇、0.5mol/L海藻糖的培养基溶液；

所述生物样本为血管组织时，所述保护剂为含2.9mol/L二甲亚砜+2.9mol/L甲酰胺+2.7mol/L乙二醇的器官保存液。