[发明专利]一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS‑Tre及其编码基因与应用。经优化的高温海藻糖酶MS‑Tre，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明经优化的高温海藻糖酶MS‑Tre编码基因与优化前的编码基因相比，可以在黑曲霉中更高效表达，重组黑曲霉菌株可以高产海藻糖酶。本发明提供的海藻糖酶稳定性好，在高温条件下也能将二糖水解成单糖，降低淀粉液化后的冷却耗能和提高淀粉质原料的利用率，提高生物能源的利用效率，降低生产成本，本发明提供的海藻糖酶MS‑Tre及其编码基因对实现海藻糖酶工业化生产具有一定的现实意义和应用价值。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种经优化的能在黑曲霉中高效表达的高温海藻糖酶MS-Tre及其编码基因与应用。

背景技术

海藻糖trehalose(α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷)是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性二糖，广泛存在于包括细菌、真菌、原生动物、植物、哺乳动物在内的有机体中。

海藻糖酶(trehalase)是一种葡萄糖苷水解酶，在酶分类上归属于水解酶，分类编号为EC3.2.1.28，可以特异性将一分子的海藻糖水解生成两分子的葡萄糖，广泛存在于细菌、霉菌、植物和动物中。根据海藻糖酶发挥酶活性的pH环境不同，可以将海藻糖酶分为酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶，酸性海藻糖酶的最适pH大约是4.5-5.5，一般分泌到胞外发挥作用，将海藻糖水解为葡萄糖供细胞利用，中性海藻糖酶的最适pH大约是7.0，一般分布在胞内，主要是分解胞内的海藻糖供生命所需。现在研究得最多的酸性海藻糖酶来源于酵母和丝状真菌，酵母中的酸性海藻糖酶定位于液泡，在丝状真菌中则定位于细胞壁。

目前关于海藻糖酶的表达研究较少，研究主要集中在重组蛋白表达和酶学性质的测定方面，已报道的海藻糖酶重组表达宿主主要为大肠杆菌和毕赤酵母，而且重组表达的海藻糖酶活力和蛋白产量都很低。Yingchun Liu等人利用毕赤酵母作为表达宿主，表达来源于绿僵菌的一个海藻糖酶，发酵上清液酶活力为5.35U/mg蛋白，从1L发酵上清液中仅可以回收到0.2mg海藻糖酶(Dmitryjuk,KrystynaPurificationand characterization of acid trehalase from muscle of Ascaris suum(Nematoda)[J].Comparative BiochemistryPhysiology Part B,2003,136(1):61-69.)；Jin-Ha LEE等人在毕赤酵母中表达来源于蜜蜂的海藻糖酶，发酵液的海藻糖酶活力仅为5.1U/ml(LeeJ H,Saito S,Mori H,et al.Molecular Cloning of cDNA for Trehalase from theEuropean Honeybee,Apis mellifera L.and Its Heterologous Expression in Pichiapastoris[J].Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan,2007,71(9):10.)；Fabiana M.de Almeida等人在大肠杆菌里表达中性海藻糖酶，破碎后上清液酶活力为0.15U/ml(Almeida F M D,Bonini B M,Beton D,et al.Heterologous expression inEscherichia coli of Neurospora crassa neutral trehalase as an active enzyme.[J].Protein ExpressionPurification,2009,65(2):185-189.)。酶学性质方面，鉴定表达出来的海藻糖酶分子量范围较广，在60kDa-170kDa，主要为中性海藻糖酶，最适pH为7.0左右，酸性海藻糖酶研究较少，最适的作用温度在30-40℃。