[发明专利]一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒，所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3‑AM，所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293、细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3‑AM以及大麻素受体拮抗剂。本发明可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

对于吸毒人员吸食大麻类毒品的检测和监管一直是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗四氢大麻抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但大麻类在人体内代谢较快，造成检测样本中目标检测成分含量极低，无法检测到。另一方面，新型合成大麻素层出不穷，且分子结构多样，使基于抗体的免疫检测法几乎不可能，甚至气质联用、液质联用也无法检测。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。

本发明构思为：无论是天然大麻素，还是各种各样的合成大麻素，其在机体内都会作用到大麻素受体这个靶点，从而产生其生物学效应。大麻素受体至少包括CB1、CB2两种类型，CB1主要存在于中枢神经系统中。大麻素受体属于GPCR类，当受到大麻素类分子激动剂作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号通路使内质网内储存的Ca²⁺迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答；如果用麻素受体拮抗剂则作用相反。由于胞质内游离钙离子浓度的测定有非常成熟的方法，因而我们通过建立稳转CB1的细胞系，建立一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质快速、高效、精准、高通量的通用检测方法。

所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将大麻素受体CB1基因克隆到CMV启动子下构建真核表达质粒，将所述真核表达质粒转染到真核永生化细胞，并建立CB1稳转细胞系，进行培养扩增得到细胞培养液；

2）步骤1）细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的5种标准液，将每种四氢大麻酚浓度的标准液均分为相同的2份；其中1份标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₁；另1份标准液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性标准液，阴性标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₂；以荧光值Y₁与荧光值Y₂之差为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程；

3）步骤1）细胞培养液中加入待测样本，配制得到样本液；取2份相同的样本液，其中1份样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₃；另1份样本液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性样本液，阴性样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₄；计算荧光强度Y₃与荧光强度Y₄之差，并带入步骤2）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质含量。