[发明专利]一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒

权利要求书

1.一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将大麻素受体CB1基因克隆到CMV启动子下构建真核表达质粒，将所述真核表达质粒转染到真核永生化细胞，并建立CB1稳转细胞系，进行培养扩增得到细胞培养液；

2）步骤1）细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的5种标准液，将每种四氢大麻酚浓度的标准液均分为相同的2份；其中1份标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₁；另1份标准液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性标准液，阴性标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₂；以荧光值Y₁与荧光值Y₂之差为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程；

3）步骤1）细胞培养液中加入待测样本，配制得到样本液；取2份相同的样本液，其中1份样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₃；另1份样本液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性样本液，阴性样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₄；计算荧光强度Y₃与荧光强度Y₄之差，并带入步骤2）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质含量；

步骤1）中，所述大麻素受体CB1基因为人源大麻素受体CB1基因；所述真核表达质粒为pCMV-CB1质粒，其制备过程为：将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建所述pCMV-CB1质粒；

步骤1）中，建立CB1稳转细胞系的过程为：将pCMV-CB1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染人胚肾细胞293得到稳转CMV-CB1的293细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选稳转CMV-CB1的293细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293；

步骤2）中，所述大麻素受体拮抗剂为NESS 0327；

步骤2）和步骤3）中的细胞内游离钙离子探针试剂均为Fluo 3-AM。

2.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，向细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制四氢大麻酚浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL的5种标准液。

3.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，所述待测样本为吸毒人员的尿液、血液、毛发、头皮屑、汗液或唾液，或者为天然大麻、天然大麻制品、合成大麻、合成大麻制品、污水、土壤、水塘中的任意一种。

4.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，进行检测胞内游离荧光钙离子荧光强度的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择488nm波长激发，以526nm波长检测胞内游离荧光钙离子荧光值。

5.一种大麻素类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3-AM，所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293、细胞内游离钙离子探针试剂Fluo3-AM以及大麻素受体拮抗剂，大麻素受体拮抗剂为NESS 0327；

所述稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293的制备过程为：所述大麻素受体CB1基因为人源大麻素受体CB1基因，将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建pCMV-CB1质粒，然后将pCMV-CB1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染人胚肾细胞293得到稳转CMV-CB1的293细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选稳转CMV-CB1的293细胞，并通过挑取克隆的方法获得所述稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293。