[发明专利]一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒，检测试剂盒分为检测组试剂和对照组试剂两种成分，检测组试剂包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1•copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂Fura Red，对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂Fura Red；空白对照单克隆细胞系copGFP/293的制备方法为：将pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到EF1‑copGFP慢病毒；将EF1‑copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293。本发明可实现所有阿片类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，可解决新型合成阿片类精神活性物质监管难的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

对于吸毒人员吸食新型阿片类精神物质，如芬太尼的检测和监管是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗芬太尼抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但芬太尼在人体内代谢较快，造成检测样本中目标检测成分含量极低，无法检测到。另一方面，新型合成的芬太尼层出不穷，且分子结构多样，使基于抗体的免疫检测法几乎不可能，甚至气质联用、液质联用也难以实现监管检测。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒。

本发明构思为：无论是天然阿片类物质，还是各种各样的合成阿片类精神物质，如芬太尼及其衍生物，其在机体内都会作用到阿片受体这个靶点，从而产生其生物学效应。阿片受体至少包括μ型、k型、δ型、和σ型四种阿片受体，μ型阿片受体是吗啡、芬太尼等阿片类精神物质亲和力和作用最强的受体。阿片受体属于GPCR类，当受到阿片类分子激动剂作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号使内质网内储存的Ca²⁺迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答。由于有非常多的钙离子指示剂可用于胞质内游离钙离子浓度的测定，因而我们通过建立同时表达绿色荧光蛋白copGFP稳转MOR1的细胞系，以copGFP为内参质控，Fura Red为钙离子荧光指示剂；单波长激发，双波长检测，以荧光钙与copGFP的荧光比值为测定参数，建立一种新型的快速简便、高效精准、高通量通用的阿片类活性物质检测方法。

所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将阿片受体基因MOR1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒；

2）将步骤1）构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；

3）步骤2）检测组培养液中加入标准品，标准品为吗啡或芬太尼，配制一系列不同标准品浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F，以测得的荧光值Ca²⁺F/荧光值PF比值作为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；