[发明专利]一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒

权利要求书

1.一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将阿片受体基因MOR1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒；

2）将步骤1）构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；

3）步骤2）检测组培养液中加入标准品，标准品为吗啡或芬太尼，配制一系列不同标准品浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F，以测得的荧光值Ca²⁺F/荧光值PF比值作为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；

4）步骤2）检测组培养液和对照组培养液中分别加入待测样本，分别配制得到样本液和对照液，样本液中的待测样本浓度与对照液中的待测样本浓度相同；样本液和对照液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，对反应后的样本液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF₁和荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F₁，对反应后的对照液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF₂和荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F₂，计算得到荧光值Ca²⁺F₁/荧光值PF₁比值与荧光值Ca²⁺F₂/荧光值PF₂比值之差，并代入步骤3）回归方程，即可计算出检测样本中的阿片类活性物质含量；

步骤1）中，阿片受体基因MOR1为人源μ型阿片受体MOR1基因；荧光蛋白为copGFP；

步骤1）构建的质粒为pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒，其制备过程为：将人源μ型阿片受体MOR1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建真核表达所述pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒；

步骤2）中，所述真核永生化细胞为慢病毒包装细胞293V，建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-MOR1·EF1-copGFP慢病毒，将CMV-MOR1·EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293；并在荧光显微镜下通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1·copGFP/293；

步骤2）中，所述空白对照质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到EF1-copGFP慢病毒；将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293。

2.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组培养液加入标准品，配制标准品浓度分别为0.01ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、1.25ng/ml和6.25ng/ml的5种检测组标准液，所述标准品为吗啡。

3.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组培养液加入标准品，配制标准品浓度分别为1pg/ml、3pg/ml、9pg/ml、27pg/ml和81pg/ml的5种检测组标准液，所述标准品为芬太尼。