[发明专利]Y染色体微缺失检测的扩增组合物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种Y染色体微缺失检测的扩增组合物及试剂盒，利用用于扩增6个STS位点(AZFa：sY84、sY86；AZFb：sY127、sY134；AZFc：sY254、sY255)和2个质控位点(ZFX/ZFY、SRY)的引物，通过多重PCR结合琼脂糖凝胶电泳技术，检测上述6个与Y染色体微缺失密切相关的STS位点，从而判断Y染色体微缺失的情况。利用本发明的扩增组合物，只需2管扩增反应就可同时对6个STS位点进行检测。

技术领域

本发明涉及染色体缺失检测技术领域，特别是涉及一种Y染色体微缺失检测的扩增组合物及试剂盒。

背景技术

Y染色体长臂上存在着影响精子发生的无精子因子(AZF)区域，进一步可分为AZFa,AZFb和AZFc三个区域。任何一个区域的微缺失都会导致男性生精障碍，引发少精子症或无精子症。在精子发生障碍引起的男性不育患者中，Y染色体微缺失的发生率仅次于Klinefelter’s syndrome(克氏综合征)，是居于第二位的遗传因素。Y染色体微缺失已成为男性不育患者的常规检查项目。

AZF的3个区域中，每个区域均有明确的序列标签位点(STS)，并且缺失断裂位置均已明确。考虑到PCR扩增影响因素众多，为了增加检测的可信度、提高灵敏度，欧洲男科学协会/欧洲分子遗传质量协作网(EAA/EMQN)联合发布的1999版、2004版、2013版《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》中均推荐在每个AZF区域选择2个STS：AZFa检测sY84、sY86，AZFb检测sY127、sY134，AZFc检测sY254、sY255，每个区域2个STS均缺失才代表该区域缺失，并指出通过以上6个STS可以检测出几乎所有临床相关的微缺失或95％文献报道的AZF缺失，足以满足常规诊断，而增加更多的位点或许有更多的科学发现，但其对临床指导意义有待进一步的探讨。同时，指南推荐采用多重PCR联合琼脂糖凝胶电泳方法来检测Y染色体微缺失，一般为2个多重PCR反应，每个反应分别检测不同区域的3个STS。

多重PCR联合琼脂糖凝胶电泳是目前Y染色体微缺失应用最为广泛的方法，经过多年的临床实践证明该方法准确、灵敏和易于操作，并且成本低廉，但是，该方法最大的困难和挑战在多重PCR引物的设计：(1)准确的定位STS位置设计引物，避免出现STS丢失现象；(2)引物设计科学合理，避免相互干扰；(3)扩增片段之间大小差距必须达到50bp以上，琼脂糖凝胶电泳时才能进行较好的区分及结果判读。这些限制在很大程度上增加了引物设计的难度。

发明内容

本发明通过对扩增引物组合及扩增体系和程序长时间的摸索和优化，并且经过了大量的临床样本实验，最终开发出了一个结果准确可靠且经济简便的Y染色体微缺失检测的扩增组合物和试剂盒。

本发明利用用于扩增6个STS位点(AZFa：sY84、sY86；AZFb：sY127、sY134；AZFc：sY254、sY255)和2个质控位点(ZFX/ZFY、SRY)的引物，通过多重PCR结合琼脂糖凝胶电泳技术，检测上述6个与Y染色体微缺失密切相关的STS位点，从而判断Y染色体微缺失的情况。利用本发明的引物和检测体系，只需2管扩增反应就可同时对6个STS位点进行检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种Y染色体微缺失检测的扩增组合物，包括下列引物组合：

(1)用于扩增Y染色体AZFa区sY84位点的引物对，其碱基序列为：

sY84-F：5'-TTTCAGCAAAGAGAAGGGTCC-3'

sY84-R：5'-TCTGAAGCCTACTACCTGGAG-3'；如序列表中SEQ ID NO:1-2所示；

(2)用于扩增Y染色体AZFa区sY86位点的引物对，其碱基序列为：

sY86-F：5'-GGGAGAAGACAGCATCTACAAC-3'