[发明专利]一种筛选适宜乳杆菌增殖的氮源的方法

说明书

本发明公开了一种筛选适宜乳杆菌增殖的氮源的方法，属于生物技术领域。本发明通过调节培养基的碳源与氮源的含量，以及调节缓冲液种类与浓度，使得在不同碳源的培养基中，干酪乳杆菌CCFM711、罗伊氏乳杆菌CCFM8631、植物乳杆菌CCFM8661菌浓最高时发酵液的pH值不低于4.0、葡萄糖含量不低于2.0g/L，同时培养基的渗透压在300～400mOsm/kg，说明菌体停止生长是因为氮源中有效氮源被完全利用结束。通过乳杆菌利用单位质量氮源的增殖效率判断乳杆菌的有效氮源，与发酵罐恒pH补糖培养结果一致，为实验室或工业上大规模筛选氮源提供了快速简便的方法。

技术领域

本发明涉及一种筛选适宜乳杆菌增殖的氮源的方法，属于生物技术领域。

背景技术

乳杆菌广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，也见于动物的口腔、阴道和肠道内。乳杆菌分解糖的能力强，分解蛋白质类的能力相对较弱。大部分的乳杆菌不能利用外源蛋白质和无机氮源，必须通过降解外源蛋白质或多肽，以保证菌体正常生长代谢过程中对氨基酸的需要。乳杆菌通常会编码相对完善的蛋白水解系统，由三部分组成：1、细胞壁水解蛋白，将胞外的大分子蛋白质水解成多个片段的多肽；2、转运系统，水解后的多肽通过菌株特定的转运系统运送至胞内，不同的多肽有不同的转运通道，每种菌株因转运系统不同进而导致可利用的氮源不同；3、胞内肽酶，运送至胞内的多肽还是不能被菌体利用，需要肽酶水解成更小分子的肽和氨基酸以供菌体生长代谢。氮源是制约乳杆菌生长代谢的关键因素，因为氮元素是构成细胞的重要成分，有些氮源例如酵母粉还可以为菌株提供生长因子。氮源筛选是培养基优化的重要步骤。

目前国内外对于氮源的筛选均基于分批培养方式，通过单因素试验和正交实验筛选优质的氮源。但是，传统方法无法通过准确的分析单位质量氮源的增殖效率以确定最适宜乳杆菌生长的氮源。因为分批培养方式氮源的添加量往往是过量的，乳杆菌生长至最大量时可能是因为pH的降低(酸抑制)或碳源缺乏，氮源中可被利用的有效氮成分并未被完全利用。另外，通过测定OD值判断菌浓的高低亦存在弊端，在乳酸菌增殖培养基优化的过程中因为碳氮不合适等会导致菌的其他代谢产物(如多糖)的产生，导致OD值很高，但活菌数不高。

发明人曾采用发酵罐恒pH补糖培养，解除了乳杆菌生长代谢中产生的酸抑制和碳源不足，能够准确分析出乳杆菌利用每种氮源的增殖效率。但是该方法引入了发酵罐的使用，耗费较大量的时间和人力，不利于氮源的快速筛选。基于此，发明一种能够快速高效筛选乳杆菌氮源的方法，将打破传统乳杆菌培养优化方法，更有效的优化利用氮源，提高乳杆菌的培养效率。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种筛选适宜乳杆菌增殖的氮源的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将不同氮源分别替换MRS培养基中的所有氮源，配制成不同氮源的培养基；

(2)将乳杆菌种子液接种到不同氮源的培养基中进行增殖培养，调节培养基的氮源为1～2g/L，碳源为5～8g/L，缓冲液种类为钠盐或钾盐缓冲液，缓冲液浓度为20～30g/L；

(3)计算乳杆菌利用单位质量的不同氮源的增殖量，单位质量增殖量相对越高的氮源越适宜乳杆菌增殖；所述单位质量增殖量为乳杆菌生长至稳定期的OD₆₀₀值除以培养基中氮源的含量。

在一种实施方式中，所述培养基的组成为：氮源1～2g/L，无水葡萄糖5～8g/L，缓冲盐20～30g/L，七水合硫酸镁0.10～0.30g/L，一水合硫酸锰0.01～0.1g/L，吐温-80 0.5～1mL/L。

在一种实施方式中，所述培养基的组成具体为：葡萄糖6.0g/L，氮源1.0g/L，K₂HPO₄10.0g/L，Na₂HPO₄ 10.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，吐温-80 1mL。