[发明专利]一种并行探测荧光发射差分显微成像的方法和装置

说明书

本发明公开了一种并行探测荧光发射差分显微成像的方法和装置，具体为：激光器发出激光光束，将其准直后转换为线偏光；对线偏振光进行相位调制，调制图案为0相位图，再将其转换为圆偏振光后投射在待测样品上进行二维扫描；使用探测器阵列收集所述待测样品发出的荧光信号，归一化处理获得并行探测荧光信号光强；将调制图案切换为涡旋相位图，再次对所述线偏振光进行相位调制，重复上述步骤再次获得并行探测荧光信号光强；最后，将两次扫描获得的并行探测荧光信号光强相减获得并行探测差分信号光强。本发明的分辨率高、信噪比好，同时能够十分简单地由传统的共聚焦显微系统改装而成，并且操作方便，对光功率的需求低。

技术领域

本发明属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种并行探测荧光发射差分显微成像的方法和装置。

背景技术

这几个世纪以来，光学显微镜在科学中发挥了重要作用，为人们观测微观结构及其运动提供了一种可行的方法。然而，阿贝衍射极限将常规荧光显微镜的分辨能力限制在约为照明光波长的一半，限制了长度尺度小于 100nm的微结构观察。为此，人们发明了各种超分辨显微技术，而共焦显微成像技术是其中应用最为广泛的一种。共焦成像系统高使用率高主要是由于该技术能够生成具有高对比度的光学切片图像，突破了普通光学显微镜衍射极限的限制，横向分辨率是相同数值孔径的普通光学显微镜的1.4 倍，纵向分辨率可以达到亚微米量级，同时具有简单性，多功能性和无创性的特点，能够满足各种样品和应用需求。

在共焦显微成像的基础上，荧光差分显微成像技术先用一个实心光斑扫描样品激发荧光，收集荧光信号，再将实心光斑调制为空心光斑用于扫描样品激发荧光，第二次收集荧光信号，最后将两个荧光信号做差分处理，得到分辨率更高的样品图像。

然而荧光差分显微成像技术和共焦显微镜都是采用针孔来滤除焦平面以外的光信号，从而实现光切片效果，但是过小的针孔会导致收集的焦面信号太弱，从而减小信噪比；较大的针孔会影响其光学切片效果，从而限制了分辨率，因此人们必须通过权衡系统的信噪比和分辨率来确定合适的针孔尺寸。与之前马也(详见文献Ma Y,Kuang C,Fang Y,etal.Virtual fluorescence emission difference microscopy based on photonreassignment[J]. Optics Letters,2015,40(20):4627.)、葛宝梁(详见文献Ge B,WangY, Huang Y,et al.Three-dimensional resolution and contrast-enhanced confocalmicroscopy with array detection[J].Optics Letters,2016,41(9):2013.)和李屹成(详见文献Li Y,Liu S,Liu D,et al.Image scanning fluorescence emissiondifference microscopy based on a detector array[J].Journal of Microscopy,2017.)提出的几种基于并行探测和差分显微技术的方法相比，本发明由于实心斑和空心斑照明成像都采用并行探测技术(马也采用空心斑照明加并行探测技术，葛宝梁和李屹成采用实心斑照明加并行探测技术)，因此具备更高的分辨率以及信噪比，从而最终能够获得质量更高的显微图像。

发明内容

本发明的目的为提供一种并行探测荧光发射差分显微成像的方法，利用该方法可以同时具备小针孔的分辨率优势与大针孔的收集效率，可以在保持高分辨率的前提下提高图像的信噪比。