[发明专利]一种食品中绵羊源成分快速检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供一种食品中绵羊源成分快速检测试剂盒，涉及生物物种鉴定技术领域。本发明首先筛选出一个绵羊源通用内标准基因CALPONIN，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在绵羊物种中拷贝数恒定，不存在等位基因变异，可作为鉴定绵羊源的靶基因。以该基因为靶序列设计了PCR扩增引物，与PCR反应液一起进行扩增，PCR反应产物用于铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测。PCR反应结合基于铂钯纳米颗粒的免疫层析试纸条检测构成快速检测试剂盒，可快速、灵敏地检测食品中的绵羊源成分，检测灵敏度可达0.8％(w/w)。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于现场实时检测。

技术领域

本发明涉及生物物种鉴定技术领域，具体的说涉及一种检测食品中绵羊源成分的聚合酶链式反应技术(PCR)结合铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测的快速检测试剂盒。

背景技术

随着经济的高速发展，人民生活水平的提高，我国居民对肉类食品的需求逐年增加。尽管许多国家明确规定要求食品标签真实明确地标出肉的种类、来源，禁止掺假行为，但是市场上仍有很多肉类掺假的事件发生，例如为了降低成本，驴肉火烧中掺入了猪肉，羊肉中掺入牛肉或猪肉，香肠中掺杂其他肉类等等行为。目前，PCR方法是检测食品掺假简单有效的方法，其操作简单、时间短、检测准确性高。因此，本发明目的是提供一种食品中绵羊源成分的快速灵敏检测试剂盒。

目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量PCR扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体DNA的浓度无法和基因组DNA的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体基因同源性极高，难以通过普通PCR实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量PCR实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。

PCR方法是目前应用比较广泛的方法，其原理是利用一种DNA聚合酶和一对与模板互补配对的特异性引物，通过一系列的变性、退火、延伸等步骤，使模板DNA总量不断增加的过程。

免疫层析试纸是为了实现快速检测而衍生出的一种高精度、低价格、易操作的检测方法，通常由样品垫、结合垫、检测线、质控线、硝酸纤维素膜、吸水垫、背板几部分组成。检测原理与酶联免疫吸附测定类似，但是检测过程更为简单、便携、易于操作。免疫层析试纸有夹心法、竞争法和间接法3种。铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条属于夹心法，其原理是将待测物质的特异性抗体交联到纳米颗粒上以及侧流层析传感器的检测线上，当纳米颗粒-抗体复合物和抗原结合后，该复合物再与检测线上包被的抗体相结合，形成三明治夹心结构。通过观察检测线和控制线颜色的变化实现目视定性检测。

铂钯纳米颗粒就是在铂纳米催化剂中引入第二金属元素钯，即在纳米铂颗粒上包裹一层钯，形成具有球壳结构铂钯双金属颗粒。铂钯纳米颗粒具有优越的类辣根过氧化物酶活性，可以在H2O2存在的情况下成功使TMB溶液显现明显的蓝色。因此，本发明将铂钯纳米颗粒应用于免疫层析试纸上，以起到增强检测线的作用，极大的提高了检测灵敏度。

本发明将特异性PCR技术同铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测结合起来，提供一种食品中绵羊源成分的快速灵敏检测试剂盒。本发明无需复杂的仪器，时间短，操作简单，灵敏度高，只需要一台普通PCR仪就可以满足检测的需求。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测食品中绵羊源成分的绵羊源通用内标准基因。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测食品中绵羊源成分的特异性PCR结合铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测的快速检测试剂盒。