[发明专利]一种在转录组测序水平上进行剑麻叶纤维发育的研究方法

说明书

本发明公开了在转录组测序水平上进行剑麻叶纤维发育的研究方法，包括以下步骤：s1.培育剑麻参试材料，并进行剑麻叶RNA的提取及质量检测；s2.进行剑麻叶纤维的转录组测序；s3.进行转录水平差异比较分析，筛选出差异表达基因；s4.进行差异表达基因的GO功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析；s5.从转录组数据中挑取两种不同表达趋势的4个基因在不同纤维发育时期进行实时荧光定量PCR试验，并与RNA‑Seq转录组数据中该基因的表达趋势进行吻合性检测，验证RNA‑Seq转录组数据的可靠性；本发明为深入开展纤维发育相关功能基因的克隆和功能验证提供理论基础，为剑麻纤维品质的遗传改良提供理论依据。

技术领域

本发明属于剑麻研究领域，具体涉及在转录组测序水平上进行剑麻叶纤维发育的研究方法。

背景技术

1.剑麻在国民生产中的地位

剑麻(学名：Agave sisalana Perr.ex Engelm.)又名菠萝麻，龙舌兰科龙舌兰属，共约300种,以普通剑麻、剑麻新变种、龙舌兰杂种11648号、灰剑麻、墨西哥麻、马盖麻、番麻、假菠萝麻、抽拉和暗绿剑麻等较多,是一种多年生热带硬质叶纤维作物，其原产墨西哥，现主要在非洲、拉丁美洲、亚洲等地种植，是当今世界用量最大，范围最广的一种硬质纤维。剑麻纤维质地坚韧，耐磨、耐盐碱、耐腐蚀，广泛应用于渔业、航海、工矿、运输、油田等事业上，以及用于编织剑麻地毯、工艺品等生活用品上,具有重要的经济价值,目前还通过剑麻纤维和玻璃纤维与酚醛树脂共混，制备出纤维混杂复合材料，强度较高、耐磨性、综合性能较好,这为剑麻纤维及制品的开发提供了极为广阔的发展前景。

我国剑麻主要分布在生长于雷州半岛及广西部分地区。我国政府对剑麻产业还将实施一系列的资金扶持和税收减免等优惠政策。目前广西壮族自治区财政厅已下拨150万元人民币用于剑麻新产品研究开发,另拨款380万元人民币用于建设剑麻优良种苗的繁殖基地和病虫害防治。农业部提出到2005年，我国剑麻种植面积要达到2万公顷的发展规划，仅广西剑麻种植面积就要达到1万公顷以上，预计年生产剑麻纤维5万吨左右。我国目前最大的剑麻制品生产基地广西剑麻工业园日前由广西剑麻有限责任公司在广西扶绥县正式开工建设。

H.11648是以假菠萝麻为母本，蓝剑麻为父本进行杂交，获得有性杂交第一代F1，再利用开花的F1作为亲本与蓝剑麻回交而获得有性杂种回交一代BC1，通过系比、选择、培育而成的，是目前种植面积最大的生产种，纤维含量较高。狐尾龙舌兰是观赏品种，剑麻含量低。剑麻纤维是取自剑麻叶片中的维管束纤维，是一种天然硬质纤维，是剑麻产业生存发展的关键。剑麻纤维长度、束纤维强力及含杂率是评定剑麻品质的重要物理指标。测定剑麻叶纤维含量对剑麻的管理和栽培都起到重要的作用。

2.高等植物纤维发育转录组测序的研究进展

转录组测序技术(又称RNA-Seq)，是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录组分析的技术，即从总RNA中富集出单链mRNA，经反转录得到双链cDNA，然后将cDNA文库中的长片段随机打断为小片段(或者是先将RNA片段化后再反转录成cDNA)，在cDNA两端加上标记性的测序接头，之后利用合适的高通量测序仪按照需求的核苷酸数量进行足够深度的转录组测序(图1)。

麻是传统的纤维作物，也是四大天然纤维之一。麻类作物的研究已经受到许多国家和政府的重视，在栽培生理、分子生物学等研究领域已取得较大成果，但转录组学方面的研究报道较少，主要集中在亚麻[4]。近年来，许多学者利用芯片杂交技术筛选出大量纤维发育相关基因，从分子水平上对纤维发育机理进行了解[5]，但该技术受参考序列的限制，不能充分检测转录本。