[发明专利]一种高效提取结核杆菌DNA的方法

说明书

本发明属于医药制备技术领域，具体涉及一种高效提取结核杆菌DNA的方法，包括使用液体培养物，灭活后再开盖，之后采用CTAB法和硅胶膜离心柱相结合的方法进行细菌DNA提取。本发明具有以下有益效果：尽可能避免了培养和提取过程中的生物安全危害；DNA提取率高，纯度高，经济实惠，且操作简单，大大节约了实验时间，尤其在处理较大样本量时经济效益明显，利于规模化应用。

技术领域

本发明属于医药制备技术领域，具体涉及一种高效提取结核杆菌DNA的方法。

背景技术

结核杆菌属于分枝杆菌属，其细胞壁中含有大量类脂，占细菌干重的23.77％，其中40％为蜡质。近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜，故结核杆菌细胞壁较一般细菌坚固，提取基因组DNA变得更加困难。随着二代测序技术的开展，结核杆菌全基因组测序工作也开展的越来越多。这对获得完整干净的结核杆菌DNA提出来更高的要求。

现有技术中，一般采用罗氏固体培养基采用结核分枝杆菌的培养，然而，结核分枝杆菌在罗氏固体培养基上长出菌落后需在BSL3级实验室(生物安全三级实验室)中开盖刮菌后进行菌株灭活和DNA提取的操作，因为开盖刮菌的过程有可能造成菌株气溶胶进而污染操作环境，容易造成操作人员菌株感染。并且，我国现在的结核病防治机构中BSL3级实验室数量非常有限，使得操作人员的感染风险大大增加。因此急需一种更加安全的菌株处理方式来进行后续DNA提取操作。

目前市面上有一些细菌基因组DNA提取试剂盒，可以快速获得DNA，但是应用于结核杆菌时，效果往往不理想。

例如，CN201410093113.0公开了一种提取结核杆菌DNA的方法以及快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性(mμLtiple drug resistence，MDR)的试剂盒。该方法包括从由临床样本提取待检DNA，应用荧光实时定量PCR确定结核分枝杆菌感染、鉴别是否为耐药性及何种耐药性菌株感染，最终确定病原体感染数量。

CN201510749457.7提供了一种结核杆菌DNA的提取纯化方法，包括以下步骤：细菌悬液经pH为8.0的EDTA洗涤离心弃上清后，加入pH为8.0的TES缓冲液和5％(W/V)的SDS溶液，加入pH为8.0的TES缓冲液和5％(W/V)的SDS溶液后，置于温水浴30～50min,再置于沸水浴30～50min，最后在冰上放置3～7min，得到混悬液。

前述方案虽对各别样本效果优异，但对于多种实际细菌的提取时，规模化应用受限，效果均不及国内外大型实验室多采用CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取结核杆菌DNA。该方法的原理是在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB法可以得到纯净的DNA，但是耗时长，操作误差大。

发明内容

针对以上技术的不足，提供了一种高效、安全、简便的结核杆菌DNA提取方法，包括使用液体培养物，报阳之后灭活，然后再开盖，之后采用改良的CTAB方法和硅胶膜离心柱法进行细菌DNA提取。

DNA提取的原理是经溶菌酶、SDS破坏细胞壁后，CTAB处理，氯仿抽提后离心去除多糖、多酚和蛋白质。上清中还加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，进一步将多糖、多酚和细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

具体地，本发明通过以下技术手段来实现：

一种高效提取结核杆菌DNA的方法，包括，使用液体培养物进行结核杆菌培养，报阳之后灭活，然后再开盖，之后采用改良的CTAB方法提取，和硅胶膜离心柱法进行细菌DNA分离。