[发明专利]一种高效提取结核杆菌DNA的方法

权利要求书

1.一种高效提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，包括，使用液体培养物进行结核杆菌培养，报阳之后灭活，然后再开盖，之后采用CTAB方法和硅胶膜离心柱相结合的方法进行细菌DNA分离。

2.根据权利要求1所述的一种高效提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，使用液体培养物进行结核杆菌培养步骤包括：使用美国BD公司BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养监测仪，待系统报阳后取出MGIT管作为后续提取DNA的样本。

3.根据权利要求1或2所述的一种高效提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，报阳之后在水浴90-100℃下灭活30分钟以上。

4.根据权利要求2所述的一种高效提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，采用CTAB法和硅胶膜离心柱相结合的方法进行细菌DNA分离包括以下步骤：

收集灭活后的菌体，离心，弃上清，菌体沉淀用TE重悬，加入溶菌酶，混匀，37℃孵育16-20小时；

加入SDS和5μL蛋白酶K溶液，混匀，孵育；

加入NaCl和预热的CTAB/NaCl溶液，旋涡震荡混匀之呈现乳白色，孵育；

加入氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀；离心；转移上层水相；

加入异丙醇和醋酸钠，混匀；

吸取混匀的液体转入吸附柱中，离心，弃掉废液；

向吸附柱中加入缓冲液GD，离心，弃掉废液；

向吸附柱中加入漂洗液PW，离心，弃掉废液；

将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

将吸附柱滴加洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，离心，收集溶液。

5.根据权利要求4所述的一种高效提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，优选吸附柱CB3、缓冲液GD及漂洗液PW均为天根生物科技有限公司产品，货号分别为RK127，RK118和RK113。

6.根据权利要求4或5所述的一种高效提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，包括：

(1).13000rcf离心3min，弃上清，菌体沉淀用400μL TE重悬，加入50μL溶菌酶(10mg/ml)，混匀，37℃孵育16-20小时；

(2).65℃预热CTAB/Nacl(室温放置会呈凝胶状，用前先在65℃预热，反复加热会影响其效果)；

(3).加入70μL 10％SDS和5μL蛋白酶K(20mg/ml)溶液，混匀，65℃孵育10min；(轻轻混匀)；

(4).加入100μL 5M NaCl和100μL预热的CTAB/NaCl溶液，旋涡震荡混匀之呈现乳白色，65℃孵育10min；

(5).加入750μL氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀；12000rpm离心5min；转移上层水相至另一新的离心管；

(6).加入0.6倍体积(约450μL)的异丙醇和0.1体积(约75μL)3mol/L的醋酸钠，轻轻颠倒混匀；

(7).600-700μL混匀的液体转入吸附柱CB3中，12，000rpm(～13，400×g)离心30sec，弃掉废液；

(8).重复步骤5；

(9).向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12，000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(10).向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12，000rpm(～13，400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(11).重复操作步骤7；

(12).将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm(～13，400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(13).将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12，000rpm(～13，400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。