[发明专利]用于膀胱癌诊断的尿液微小RNA靶基因数据库比值模型建立方法

权利要求书

1.一种用于膀胱癌诊断的尿液微小RNA靶基因数据库比值模型建立方法，其特征在于：该比值模型的建立方法步骤如下：

（1）模型数据信息采集：采集has-miR-182-5p和has-miR-152-3p在miRBase数据库相关信息；

（2）尿液标本收集及保存：样本的收集采用15ml无菌无酶离心管，收集晨尿新鲜尿液7ml，其中加入3.54g异硫氰酸胍（sigma），待溶解完全后加入HEPES盐溶液（Thermo）调节尿液样本的PH值至7，最终定容至总体积10ml，此时HEPES浓度为0.5 mol/l，异硫氰酸胍浓度为3mol/l，样本统一在-80℃条件下保存；

（3）样品中总RNA的制备：

a.将收集的尿液样本解冻，充分混运，室温下裂解5分钟；

b.加入5ml氯仿，剧烈震荡，室温静止后溶液形成分层后，4℃条件下12000rpm离心15分钟，离心后混合液体分层为下层酚氯仿相，中层蛋白层，上层无色水相，RNA全部被分配与水相中；

c.量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇（如：300 μl的转移液加100 μl无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2 min, 室温 12,000 rpm离心30 sec，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液；

d.量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2 min，室温 12,000 rpm 离心30 sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute；

e.向吸附柱miRelute中加入500 μl去蛋白液MRD，室温静置2 min，室温 12,000 rpm离心30 sec，弃废液；

f.向吸附柱miRelute中加入500 μl漂洗液RW，室温静置2 min，室温 12,000 rpm离心30 sec，弃废液；

g.重复操作步骤6；

h.将吸附柱miRelute放入2 ml收集管中，室温 12,000 rpm 离心1 min，去除残余液体；

r.将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5 ml离心管中，加20μl RNase-FreeddH₂O，室温放置2 min，室温 12,000 rpm 离心2 min，获得总miRNA，miRNA溶液保存于-80℃冰箱。

（4）第一链cDNA序列的合成：

取PCR管配置反转录体系，反转录体系为：2×miRNA RT Reaction Buffer 10µl:，miRNA RT Enzyme Mix 2µl，上步提取的总miRNA溶液8 µl ，总体积20µl。反应条件为：42℃60min，95℃ 3min。使用Analytik Jena PCR扩增仪PowerCycler进行反转录，cDNA置于-20℃储存备用；

（5）荧光定量PCR检测：

使用反转录得到的cDNA样品进行检测。反应体系为：2×miRcute Plus miRNA PreMix:10 µl，Reverse Primer 0.4 µl，Forward Primer 0.4 µl，miRNA第一链 cDNA 2 µl，ddH2O补足至20µl，实时PCR反应条件：95℃ 15min；94℃20sec，63℃ 30sec，72℃34sec，5个循环；94℃ 20sec，60℃34sec，40个循环。每个孔设3次重复，取平均值进行计算，每对引物设置阴性质控，采用ddH₂O作为阴性模板对照，扩增反应在实时荧光定量 PCR 仪 LightCyler480上进行；

（6）计算方式：

miRNA检测结果Ct的比值（Ct _182-5p/Ct _152-3p）作为诊断指标。