[发明专利]一种吴李碘泡虫壳瓣的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种吴李碘泡虫壳瓣的分离纯化方法，包括组织样品匀浆、孢子纯化、超声破碎、Percoll离心沉降、壳瓣回收、二次纯化、回收液重悬清洗。该方法主要利用壳瓣和其他杂质质量比重的不同实现了壳瓣和杂质的分离，采用100%的Percoll分离液对孢子破碎液进行离心，在Percoll分离液中部可获得纯度接近100%的完整壳瓣。本发明弥补了目前对壳瓣获取实验方法的空白，对了解粘体动物生物学特性、阐明粘体动物抗药机制以及开发粘孢子虫病害防控手段具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种吴李碘泡虫壳瓣的分离纯化方法。

背景技术

粘孢子虫(myxozoans)是一类主要感染鱼类的后生动物寄生虫，能导致养殖鱼类的重大病害发生。其中，吴李碘泡虫(Myxobolus wulii,LandsbergLom,1991)是异育银鲫“肝孢病”的病原，经过移行与发育最终在鱼体肝脏形成大小不等的孢囊，夺取宿主营养、造成机械压迫，最终导致鱼体死亡。多年来，该病在湖北、江苏等地大面积暴发，造成大量异育银鲫死亡，严重危害了相关产业发展。当前“肝孢病”的防治面临着若干瓶颈。一方面，吴李碘泡虫成熟孢子外覆坚硬的壳瓣，其主要成分可能包括几丁质，一般药物难以透过杀灭。另一方面，相较基于外部病征和镜检孢子的传统诊断方法，免疫学检测虽然提供了一个更为快速、灵敏的早期检测平台，但由于其开发流程具有较高的随机性，指向性地建立孢子特定结构的单克隆抗体仍有一定困难。因此，获得纯化的吴李碘泡虫壳瓣，不仅有助解析壳瓣成分、阐明抗药机制、开发新药，同时对于提供高质量抗原、优化早期检测手段、控制疾病监控成本也有着重大意义。基于此背景，急需建立吴李碘泡虫的壳瓣分离技术，为建立“肝孢病”的防控手段提供技术支持，保障异育银鲫养殖业的健康发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纯化效果明显、重复性好、简便易行的吴李碘泡虫壳瓣的分离纯化方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

吴李碘泡虫壳瓣的分离纯化方法，包括组织样品匀浆、孢子纯化、超声破碎、Percoll离心沉降、壳瓣回收、二次纯化、回收液重悬清洗，具体步骤如下：

A、组织样品匀浆：将镜检发现含有吴李碘泡虫孢囊的鲫肝脏剪下，放入匀浆器中，加入0.1M PBS缓冲液充分研磨，直至匀浆器中无明显组织块；

B、孢子纯化：用双层医用纱布过滤匀浆，收集滤液；用0.1M PBS缓冲液离心清洗2-3次后重悬；通过蔗糖密度梯度离心分离出孢子，PBS缓冲液清洗后重悬；

C、超声破碎：将孢子悬液置于冰上，超声波破碎仪破碎，获得孢子破碎液；

D、Percoll离心沉降：依次在离心管中加入100％Percoll分离液和孢子破碎液，以7000-9000rpm转速，离心14-16min，待破碎孢子达到沉降平衡后静置；

E、壳瓣回收：吸取分离液中部的白色漂浮物；

F、二次纯化：重复步骤D、E，将吸出的液体转移至离心管中；

G、回收液重悬清洗：加入0.1M PBS缓冲液离心清洗2-3次，获得高纯度吴李碘泡虫壳瓣，用0.1M PBS缓冲液重悬壳瓣，调节至所需浓度。

进一步地，步骤B中蔗糖离心液的梯度为30％、40％、50％、60％，步骤C中超声破碎参数为，强度：13％，工作时间：3s，间隔时间：1s，总工作时间:3-4min。

本发明的优点及有益效果：本发明提供的吴李碘泡虫壳瓣的分离纯化方法，利用壳瓣和其他杂质的质量比重不同实现了壳瓣和杂质的分离，其工艺简单、操作便捷、成本低廉，可获得纯度接近100％的完整壳瓣。本发明弥补了目前对壳瓣获取实验方法的空白，对了解粘体动物生物学特性，阐明粘体动物抗药机制以及开发粘孢子虫病害防控手段具有重要意义。

附图说明