[发明专利]快速检测小麦光周期基因Ppd-B1甲基化水平的引物、方法及应用

说明书

本发明公开了一种快速检测小麦光周期基因Ppd‑B1甲基化水平的引物、方法及应用，该引物包括Ppd‑B1‑HpaII‑F1和Ppd‑B1‑HpaII‑R1，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该方法包括以下步骤：利用CTAB法提取小麦材料基因组DNA；对小麦材料基因组DNA进行酶切处理；对酶切后的产物进行PCR扩增处理；用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如获得扩增产物的分子量为586bp的扩增片段，表明鉴定材料为Ppd‑B1高甲基化类型，否则表明鉴定材料为Ppd‑B1低甲基化类型。该方法不仅结果准确，而且大大降低了反应成本和反应时间。

技术领域

本发明属于分子生物技术与育种应用领域，具体地说，涉及一种快速检测小麦光周期基因Ppd-B1甲基化水平的引物、方法及应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)是重要的粮食作物，培育高产优质小麦品种对解决全球粮食问题具有重要意义。在小麦“绿色革命”中，光周期不敏感特性决定的地域间广泛适应能力是高产小麦的重要特征。深入研究控制小麦光周期不敏感位点形成的机理，开发简便有效的分子标记并将其应用于生产实践，对于提高小麦对环境的适应性，扩大引种范围都具有重要意义。

小麦有三个控制光周期的主效基因，根据光周期不敏感型定名为Ppd-1、Ppd-2、Ppd-3，分别把它们定位于小麦2D、2B和2A染色体上，也称Ppd-D1、Ppd-B1、Ppd-A1(WelshJR,Keim DL,Pirasteh B,et al.Genetic control of photoperiod response inwheat.Proceeding of the 4th International Wheat Genetics Symposium.Universityof Missouri,Columbia,Mo,USA.1973:897-884.；Law CN,Sutka J,Worland AJ.Geneticstudy of day-length response in wheat.Heredity,1978,41:185-191.)。Ppd-B1基因是小麦重要光周期基因，该基因对小麦光周期不敏感性具有重要作用。Sun等(Sun H,Guo Z,Gao L,Zhao G,Zhang W,Zhou R,Wu Y,Wang H,An H,Jia J.DNA methylation pattern ofPhotoperiod-B1 is associated with photoperiod insensitivity in wheat(Triticumaestivum).New Phytologist,2014,204(3),682-692.)研究表明Ppd-B1基因启动子区域的DNA甲基化水平影响其光周期不敏感位点的形成，甲基化水平与小麦重要农艺性状包括抽穗期、株高、千粒重存在相关性，高甲基化类型在小麦品种选育过程中受到选择。开发能够快速鉴定Ppd-B1甲基化水平的分子标记，对于辅助小麦分子育种及抽穗期遗传改良均具有重要意义。

目前，已报道两种检测Ppd-B1基因DNA甲基化水平的方法：重亚硫酸盐测序法(Bisulfite genomic sequencing)和联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法(CombinedBisulfite Restriction Analysis)(Sun et al.,2014)。上述两种方法尽管可以鉴定Ppd-B1基因DNA甲基化水平，但是鉴定成本高且所需时间长，具体比较如下：

(1)重亚硫酸盐测序法：鉴定一份样品费用如下：①重亚硫酸盐转化基因组DNA(Zymo Research：30元/1次反应)；②PCR扩增(TaKaRa EpiTaq^TMHS：8元/50ul反应体系)；③胶回收(天根：4元/1次反应)；④连接(全式金pEASY-T1Cloning Kit：25元/1次反应)；⑤克隆测序(上海生工：180元/至少10个克隆测序)。综上，鉴定一份样品需要至少约250元。且该方法不仅费用昂贵，而且需2～3天的时间才能获得结果。