[发明专利]一种获得非转基因耐储存鲜食枸杞的方法

权利要求书

1.一种制备耐储存鲜食宁杞7号枸杞的方法，包括如下步骤：在目的枸杞宁杞7号的细胞或组织中导入Cas9蛋白和特异sgRNA-LbPL1，得到耐储存的鲜食枸杞；

所述sgRNA-LbPL1的靶序列为序列表的序列7所示的核酸分子；

所述sgRNA-LbPL1为如下(d1)或(d2)：

(d1)序列表的序列4编码的RNA；

(d2)序列表的序列10所示的核酸分子；

所述Cas9蛋白和sgRNA-LbPL1通过基因枪转化的方法导入所述宁杞7号中，方法如下：

1)、制备二氧化硅装载Cas9蛋白和sgRNA-LbPL1

选取孔径为10nm的二氧化硅Au-MSN为介质，将20mg的Au-MSN加入5mL pH7.4的磷酸盐缓冲液中进行超声处理，随后再加入7mg纯化好的Cas9蛋白；将此混合体在22℃搅拌24小时，再用12000rpm离心，弃上清，将沉淀再用PBS缓冲液旋起，得到Cas9蛋白-Au-MSN介质；将4μL的体外转录的sgRNA-LbPL1加入到10μL Cas9蛋白-Au-MSN介质中，再加入12.5μL 2.5M的CaCl₂和5μL 0.1M的亚精胺，再5000rpm离心15s，弃上清用，再用100％的酒精洗涤沉淀两次，再用5μL的100％酒精悬起mRNA包裹的载有Cas9蛋白的Au-MSN，形成sgRNA-Cas9-Au-MSN复合体；

2)、基因枪转化枸杞叶盘

1)取宁杞7号的种子经3％NaClO灭菌后放在MS培养基上发芽，而后每隔两周剪取2cm的茎段，扦插至1/2MS培养基上扩繁；

2)在诱导培养基上覆盖两层中性滤纸，剪取枸杞无菌叶片，远轴端朝上，放置于诱导培养基上，预培养1天；

3)用Bio-Rad PDS-1000/He基因枪对叶片进行轰击，将5μL的sgRNA-Cas9-Au-MSN复合体装载在载样膜上；利用基因枪进行轰击，每次所述轰击的轰击距离为6cm，轰击压力为1100psi，轰击直径为2cm；

4)轰击后的叶片放置到25℃光照培养2天，然后切成9mm²的方块，分别接种在诱导培养基上，25℃光照培养2-4周，每两周继代一次；

5)将诱导出的愈伤组织继代至分化培养基上，诱导成苗；

6)将2cm以上的小苗继代至生根培养基上，14-28天后，获得T0代基因编辑后枸杞植株。