[发明专利]一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法

说明书

本发明公开一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，涉及生物工程纯化技术领域。该方法包括16％预制胶配制、10xTBE缓冲液配制、PAGE胶配制、加样跑样四个步骤，上样前加饱和尿素溶解引物，一方面可以使样品变性，另一方面可以增加样品比重，使得样品加入凹槽时使引物下沉，与分离方法配套的凝胶电泳槽包括低温恒温箱、电泳槽主体，电泳槽主体放置于低温恒温箱的内部，低温恒温箱内设有冷凝器、第二温度传感器并盛装有乙醇，通过冷却乙醇的循环冷却，能够保持电泳缓冲液的低温恒温，不会造成由于温度升高而使条带变形的情况，大大节约了需要更换缓冲液的控温成本。

技术领域

本发明涉及生物工程纯化技术领域，具体涉及一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法。

背景技术

目前，针对寡核苷酸引物的纯化，聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE，PolyacrylamideGel Electrophcresis)是一种应用较为广泛的方法，该方法是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，通过对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法，常用于分离蛋白质和寡核苷酸。作用原理是凭借聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

PAGE纯化基于尺寸和象分离全长产物和失败序列，可以分离120碱基以内相差一个碱基的引物，从而提供高纯度的引物。纯化后的DNA纯度大于90％，相比与其他纯化方法，PAGE纯化对大于50mer的长链01igo DNA的纯化特别有效，制品纯度能够达到90～95％。PAGE纯化虽然纯化效果较好，而且可以直观的看到DNA合成片段的质控环节，但是PAGE纯化实验步骤多、费人力、电泳及后处理过程样品损失量大以及电泳时间长，纯化时间长达6-8小时，这样不利于大规模的DNA引物纯化。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，包括16％预制胶配制、10xTBE缓冲液配制、PAGE胶配制、加样跑样四个步骤，上样前加饱和尿素溶解引物，一方面可以使样品变性，另一方面可以增加样品比重，使得样品加入凹槽时使引物下沉，与分离方法配套的凝胶电泳槽能够保持低温恒温，不会造成由于温度升高而使条带变形的情况。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，包括以下步骤：

1)16％预制胶配制：将4200g尿素、1520g丙烯酰胺、80g甲叉双丙烯酰胺、1L10xTBE缓冲液混合后，使用超纯水定容至10L；

2)10xTBE缓冲液配制：将108g三羟甲基氨基甲烷、55g硼酸、7.44g乙二胺四乙酸二钠，加入超纯水用磁力搅拌器搅拌溶解，最后用超纯水定容至1L；

3)PAGE胶配制：先将胶板用夹子和橡皮条夹好，用量筒量取500mL/400mL的16％预制胶，倒入500mL蓝盖瓶，然后迅速加入1.5mL/1.2mL的10％过硫酸铵溶液和0.5mL/0.4mL的四甲基乙二胺，充分震荡静止几秒，待气泡排出时倒入胶板，倒完后插上梳子等待胶凝固；当胶板上摸起来发热时则胶开始逐渐凝固形成凝胶层；凝固之后缓慢将梳子用钢尺拔出来，再将梳子插入后产生的两个凹槽残胶给捣出来，并用水冲洗干净；将板子底部的条子抽走，胶板擦干净后放入凝胶电泳槽，用夹子夹紧，在上面倒入1xTBE缓冲液淹没凹槽上方；

4)加样跑样：上样前把样品抽干后，加入适量饱和尿素溶解，用移液枪吸入后，缓慢打进凹槽；有修饰的外面用袋子罩好避光，窗帘拉好；无修饰的要做标记；然后打开电源、单向阀、冷却器、冷凝器，乙醇循环箱内的乙醇经过冷却器、单向阀、螺旋盘管进入低温恒温箱内，在电压600V条件下样品跑样6-8h即可。