[发明专利]一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法

权利要求书

1.一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）16%预制胶配制：将4200g尿素、1520g丙烯酰胺、80g甲叉双丙烯酰胺、1L 10xTBE缓冲液混合后，使用超纯水定容至10L；

2）10xTBE缓冲液配制：将108g三羟甲基氨基甲烷、55g硼酸、7.44g乙二胺四乙酸二钠，加入超纯水用磁力搅拌器搅拌溶解，最后用超纯水定容至1L；

3）PAGE胶配制：先将胶板（26）用夹子和橡皮条夹好，用量筒量取500 mL的16%预制胶，倒入500mL蓝盖瓶，然后迅速加入1.5 mL的10%过硫酸铵溶液和0.5 mL的四甲基乙二胺，充分震荡静止几秒，待气泡排出时倒入胶板，倒完后插上梳子等待胶凝固；当胶板上摸起来发热时则胶开始逐渐凝固形成凝胶层（27）；凝固之后缓慢将梳子用钢尺拔出来，再将梳子插入后产生的两个凹槽残胶给捣出来，并用水冲洗干净；将板子底部的条子抽走，胶板（26）擦干净后放入凝胶电泳槽，用夹子夹紧，在上面倒入1xTBE缓冲液淹没凹槽（28）上方；

4）加样跑样：上样前把样品抽干后，加入适量饱和尿素溶解，用移液枪吸入后，缓慢打进凹槽（28）；有荧光修饰的样品外面用袋子罩好避光，窗帘拉好；无荧光修饰的样品要做标记；然后打开电源（23）、单向阀（5）、冷却器（6）、冷凝器（11），乙醇循环箱（7）内的乙醇经过冷却器（6）、单向阀（5）、螺旋盘管（10）进入低温恒温箱内，在电压600V条件下样品跑样6-8h即可；

12bp及以下的DNA使用20%的预制胶，12-60bp的DNA使用16%的预制胶，60bp以上的DNA使用12%的预制胶；

所述凹槽的上样量不超过150 OD；

所述凝胶电泳槽包括低温恒温箱（1）、电泳槽主体（2），电泳槽主体（2）放置于低温恒温箱（1）的内部，低温恒温箱（1）内设有冷凝器（11）、第二温度传感器（12）并盛装有乙醇；电泳槽主体（2）包括上电泳池（21）、下电泳池（22）、电源（23），上电泳池（21）与下电泳池（22）内均盛装有电泳缓冲液，电源（23）的正极导线（24）延伸入下电泳池（22）的电泳缓冲液中，电源（23）的负极导线（25）延伸入上电泳池（21）的电泳缓冲液中；上电泳池（21）与下电泳池（22）之间设有两块长方形的胶板（26），两块胶板（26）之间容置有凝胶层（27），凝胶层（27）的顶部设有用于添加样品的凹槽（28）；

所述低温恒温箱（1）的内壁与外壁之间设有螺旋盘管（10），螺旋盘管（10）的一端通过管道与第一流量计（3）连接，另一侧通过管道与第二流量计（4）连接，第一流量计（3）与第二流量计（4）在低温恒温箱的外部连接管路上设有单向阀（5）、冷却器（6）、乙醇循环箱（7）；

所述低温恒温箱（1）的外壁（13）与内壁（14）之间设有蓄冷保温层（15），内壁（14）纵截面的四个边角处均设有冷却液错流机构，冷却液错流机构包括防水电机（16）、联轴器（17）、搅拌叶轮（18），防水电机（16）、联轴器（17）、搅拌叶轮（18）依次同轴连接且轴线均延伸至内壁（14）纵截面的中心点处；

所述冷却器（6）内设有PLC控制器（8）、第一温度传感器（9），PLC控制器（8）与冷却器（6）、冷凝器（11）、第一温度传感器（9）、第二温度传感器（12）均信号连接；

该凝胶电泳槽的工作方法如下：

S100、使用移液枪向凹槽（28）内注入样品后，将电泳槽主体（2）放置在低温恒温箱（1）内，开启电源（23），电源的正负极分别通过正极导线（24）、负极导线（25）与电泳缓冲液形成回路，发生引物的电泳纯化分离；

S200、开启冷凝器（11）、冷却器（6），冷凝器（11）、冷却器（6）分别对低温恒温箱和乙醇循环箱（7）内的乙醇进行降温，打开单向阀（5），冷却器（6）冷却后的乙醇经单向阀（5）、第一流量计（3）进入低温恒温箱的内壁与外壁之间，同时乙醇还可沿第二流量计进入乙醇循环箱（7）中，形成乙醇循环回路；

S300、第一温度传感器（9）、第二温度传感器（12）实时检测冷却器（6）与低温恒温箱（1）内的温度；当第一温度传感器（9）、第二温度传感器（12）检测到的温度有一个达到13-16℃时，PLC控制器（8）控制冷却器（6）、冷凝器（11）关闭；当第一温度传感器（9）、第二温度传感器（12）检测到的温度高于16℃时，PLC控制器（8）控制冷却器（6）、冷凝器（11）开启，在低温恒温箱（1）与电泳槽主体（2）的冷交换中，可以保持电泳缓冲液处于13-16℃的低温恒温状态。