[发明专利]马、驴源性成分二重PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种阿胶及原料中马、驴、骡源性成分二重PCR检测试剂盒，属于动物源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒包括马和驴特异性引物、反应试剂、阳性对照以及空白对照。所述引物包括马特异性引物(Horse‑F、R)、驴特异性引物(引物对1：Donkey‑1‑F、R或引物对2：Donkey‑2‑F、R)。可以用于皮张及阿胶等马、驴等不同来源成分的鉴定。本发明检测方法稳定性好、特异性强、操作简单、结果判断直接，可为阿胶企业和食品药品监管部门提供有效、精准、可靠的驴皮及其阿胶制品的鉴定方法，也为阿胶企业原料采购及其阿胶制品真实性保驾护航。

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及阿胶及原料中马、驴、骡源性成分二重PCR检测试剂盒。

背景技术

阿胶是马科动物驴的干燥或鲜皮张经煎煮、浓缩而制成的固体胶。其具有增强体质、改善睡眠、健脑益智、延缓衰老、防治癌症等作用。然而，由于目前驴的养殖量远远不能满足市场的需求，且一些马皮、骡皮很难通过肉眼与驴皮进行鉴别，使得在原料采购中难以保证皮张的真实性，导致市场上大量出现驴皮掺假的现象。阿胶中马皮和骡皮的掺假不仅影响其功效，还可能危害消费者的身体健康。同时，阿胶掺假也是一种欺诈行为，使企业和政府都失信于消费者，造成了极坏的社会影响。因此，建立简便的、可靠的、有效的皮张原料和阿胶成品的检测方法，对于生产企业、监管部门以及消费者都具有重要意义。

针对马、驴和骡的皮张鉴别，传统方法主要是通过观察皮张外表、颜色和辨别气味，但这种方法很难区分与驴皮相似度高的马皮和骡皮。近年来，随着分子生物技术的发展，可以利用各种物种所具有的不同基因组信息进行鉴别，与传统分析方法相比，这种DNA分子检测技术具有客观性和准确性。公开号CN104046700A专利采用5重多色荧光定量PCR检测技术，利用CKM核基因(nDNA)和线粒体基因组DNA(mtDNA)的16SrRNA基因对驴、马、马骡和驴骡进行鉴别。此方法检测成本较高，且需要大型昂贵仪器，不适合驴皮的大批量鉴定，再者此方法不涉及检测阿胶中的动物源性成分。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于马、驴、骡皮张鉴别的试剂盒；

本发明的第二个目的在于提供一种可用于阿胶中马和驴源性成分鉴定的试剂盒；

本发明的目的还在于提供一种马、驴、骡皮张鉴别方法和阿胶中马、驴源性成分的鉴定方法。

为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性等方面进行马和驴特异序列的筛选，通过对非目标物种及目标物种中不同品种的检测筛选，分别选取马和驴中特异性的基因片段作为检测靶标并设计特异性引物，利用PCR扩增和电泳技术对其种间特异性、种内保守性和灵敏度等进行测试。经过大量分析和实验验证，最终获得可供检测使用的马、驴基因组特异DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。

基于此，本发明首先提供一种马和驴特异性引物，其特异性扩增SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段。

优选地，引物长度为20～24bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等。

优选地，该引物序列如列表1：

表1本发明设计的PCR扩增引物

进一步本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、阳性对照DNA、双蒸水。

所述阳性对照DNA为马或驴基因组DNA，所述空白对照为双蒸水。