[发明专利]核桃乳DNA的提取方法

说明书

本发明筛选得到了psba‑trnH作为鉴定核桃乳的最适DNA条形码。基于此，设计了针对核桃的特异性引物对，制备了相关试剂盒，并利用它们对核桃乳的真伪性进行鉴定。本发明的鉴定方法准确快速，应用范围广，具有良好市场应用前景。

技术领域

本发明涉及DNA提取方法领域，尤其涉及适合核桃乳DNA条形码分析的DNA提取方法。

背景技术

核桃乳不仅具有纯天然的植物蛋白原材料、不失核桃仁原有营养成份和增强大脑记忆功能的特点，还是蛋白质、维生素B、尼克酸以及多种微量元素的良好来源，在我国一直属于畅销产品。然而，核桃乳掺杂使假现象层出不穷，手段和方式不断翻新，检测和鉴定困难重重，因过敏源成分不明对消费者的人身健康构成威胁，因此，急需建立一种快捷、准确的真伪鉴定方法。DNA条形码(DNA barcoding)是一种新型的物种鉴定系统、它利用标准的短基因区域作为标记对物种进行快速、准确和高效鉴定。现DNA条形码已应用在中草药、水产品及加工食品等多领域的物种鉴定。

核桃乳DNA提取是开展核桃乳DNA条形码真伪鉴定的首要环节，核桃乳属深加工食品，繁琐的加工过程使种源物种核桃的DNA严重破坏降解，DNA提取困难，文献也有一些相关方法报道，可总结为CTAB方法、试剂盒方法与改良试剂盒方法。任君安等对果蔬汁饮料DNA提取方法做了研究，通过比对CTAB与植物DNA提取试剂盒方法，得到了改良试剂盒方法。韩晴等在基于植物DNA条形码技术对杏仁露中花生源性成分鉴别研究中，采用改良深加工食品试剂盒方法，得到具备扩增条件的杏仁露DNA。但提取的DNA浓度低，纯度不高，质量不佳。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供了核桃乳DNA提取最佳处理方式，并对两种CTAB裂解法和三种试剂盒方法进行比较，尝试了CTAB与试剂盒方法结合，筛选出适合核桃乳DNA高质量提取的最佳提取方法。AxYGen与CTAB结合方法可作为核桃乳DNA条形码分子检测中模板DNA提取的通用性方法。

本发明的一个目的是提供一种核桃乳DNA的提取方法，包括如下步骤：

1)将核桃乳样品真空冻干，研磨冻干粉，加入CTAB裂解液3、RNase和蛋白酶K，转移至灭菌管中，加入AxYGen AxyPrep Multisource Genomic DNA Kit中的BufferC-L，50-60℃孵育1-3小时；其中CTAB裂解液3中含有β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮；

2)加入酚:氯仿:异戊醇，混匀，加入AxYGen AxyPrep Multisource Genomic DNAKit中的BufferP-D，抽提，离心；

3)将上层水相转移至新的离心管中，加入氯仿：异戊醇，离心；

4)将上清转移至新的离心管中，加入异丙醇，冰箱静置，离心，弃上清，保留沉淀，乙醇洗涤。

在另一个实施方案中，CTAB裂解液3中β-巯基乙醇的量为0.2％(v/v)，聚乙烯吡咯烷酮的量为2％(w/v)。在另一个实施方案中，CTAB裂解液3的成分如下：3％(w/v)CTAB；0.1mol/L Tris-HCL，pH调控为8.0；0.02mol/L EDTA；1.4mol/L NaCl；0.2％(v/v)β-巯基乙醇，2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮。

在另一个实施方案中，Buffer C-L的加入量是每100mg真空冻干样品加入200-400μL，优选300μL。Buffer P-D的加入量是每100mg真空冻干样品加入400-600μL，优选500μL。在另一个实施方案中，其中孵育温度和时间为56℃孵育2h。在另一个实施方案中，其中真空冻干是采用真空冻干机冻干48小时。

本发明的另一个目的是提供一种核桃乳DNA提取方法，包括如下步骤：