[发明专利]游离DNA提取富集试剂盒及游离DNA提取方法

说明书

本发明公开一种游离DNA提取富集试剂盒，包括样本裂解液、结合液、一次洗涤液、二次洗涤液、洗脱液和纳米磁珠，样本裂解液包括无核酸酶水、试剂A和试剂B，试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中至少一种，试剂B为Tween20、Triton‑X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中至少一种；结合液中除样本裂解液的成份外还包括试剂C，试剂C为异丙醇和无水乙醇中至少一种；一次洗涤液成份与结合液相同；二次洗涤液为无核酸酶水、摩尔浓度为0.1‑1M氯化钠溶液、Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种；洗脱液为无核酸酶水，Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种。本发明还公开了一种游离DNA提取方法。本发明解决了现有技术中有机溶剂有一定毒性的技术问题。

技术领域

本发明涉及DNA检测领域，具体涉及一种游离DNA提取富集试剂盒及游离DNA提取方法。

背景技术

核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是一类带有遗传信息的生物大分子。血中游离DNA(cell free DNA,cfDNA)简称循环脱氧核糖核酸，是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA；研究发现，游离DNA也含有非常重要的遗传信息。近年来，游离DNA研究成为基因组分子诊断研究的一个热门领域，目前已被临床逐渐运用到了从肿瘤的最初诊断到治疗、发展的各个阶段，包括：早期筛查，评估肿瘤的异质性，转移复发风险和预后评估、实时监控治疗反应和耐药，肿瘤分期分级和指导治疗方案选择等。

cfDNA在血循环中的含量很低，且极易被丰度较高的非cfDNA污染和稀释，尤其是早期癌症患者。而且，原发性脑瘤患者的cfDNA可能由于血脑屏障的阻隔作用难以在外周血中被检测到，这给cfDNA的检测带来了极大挑战。使用cfDNA进行检测的第一步就是要对人类血清血浆中的cfDNA进行提取纯化，提取产物的质量直接影响到后续检测结果的准确性和可靠性。而游离DNA的片段小、在血清和血浆中含量低等特性给cfDNA提取的得率提出了更高的要求。目前核酸提取方法主要有酚/氯仿抽提、离心柱法和磁珠法。酚/氯仿抽提因大量使用有毒溶剂，对操作者毒性较大，操作步骤繁琐，难于实现自动化操作。离心柱法因其游离核酸提取效率低、成本高，且需要高速离心机，也难于实现自动化，均不能广泛适用于大规模的临床检测。近年发展起来的磁珠法提取核酸技术，其采用超顺磁性纳米颗粒，利用在高盐条件低pH下吸附核酸，然后在低盐高pH下分离核酸的原理进行样本核酸的分离纯化，因其只需要在磁场作用下就高效简易地将核酸分离纯化出来，故其能实现高通量自动化标准化操作。

目前市场上游离DNA提取富集试剂盒中的溶液是根据不同的提取方法相应设计，比如基于酚/氯仿抽提的试剂盒，大多通过酚、氯仿和异戊醇来变性蛋白质使其沉降，并使液体分层，再用乙醇等沉淀离心，达到提取目的；但上述有机溶剂有一定的毒性，不利于技术人员操作。而离心柱法和磁珠法则多采用高盐低pH的原理制备结合液，使得核酸在该条件下与离心柱的硅胶膜或磁珠相结合；再采用低盐高pH的条件制备洗脱液，便于核酸洗脱。这一原理虽广泛应用于核酸的提取，但并不完全适用于游离核酸的提取，主要体现在：1.游离核酸的片段长度相对于基因组核酸短，游离DNA主峰长度在170bp左右,游离RNA小于1000nt，在一般高盐溶液中难以与磁珠高效结合；2.游离核酸的含量少，残留的杂质和盐将会严重影响后续测量和下游应用。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种游离DNA提取富集试剂盒及游离DNA的提取方法，旨在解决的现有的游离核酸提取法中，有机溶剂有一定毒性的技术问题。