[发明专利]游离DNA提取富集试剂盒及游离DNA提取方法

权利要求书

1.一种游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，包括样本裂解液、结合液、一次洗涤液、二次洗涤液、洗脱液和纳米磁珠，所述样本裂解液成份包括无核酸酶水、试剂A和试剂B，所述试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种，所述试剂B为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中的至少一种；所述结合液中除样本裂解液的成份外还包括试剂C，所述试剂C为异丙醇和无水乙醇中的至少一种；所述一次洗涤液的成份与结合液相同；所述二次洗涤液为无核酸酶水、摩尔浓度为0.1-1M氯化钠溶液、Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种；所述洗脱液为无核酸酶水，Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种。

2.根据权利要求1所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述样本裂解液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为2-6M的试剂A与质量浓度为5％-20％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节制成。

3.根据权利要求1所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述结合液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为1-6M的试剂A与质量浓度为5％-20％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA调节并与15％-55％体积的试剂C混合制成。

4.根据权利要求1所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述一次洗涤液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为0.5-4M的试剂A与质量浓度为0.5％-10％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节并与15％-55％体积的试剂C混合制成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述纳米磁珠其磁核为铁钴镍合金Fe-Co-NiO_X，粒径分布在300-400nm之间。

6.根据权利要求5所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述磁核的表层由内到外依次至少包覆有碳层和无机二氧化硅层，且在最外层共价接枝有聚乙二醇。

7.一种游离DNA的提取方法，其特征在于，利用权利要求1至6中任一项所述的游离DNA提取富集试剂盒完成，所述方法包括以下步骤：

按照先添加蛋白酶K，然后添加样本，最后加入裂解液的顺序，在离心管中依次添加各个组分，震荡混匀各组分并孵育，以进行样品裂解；

将纳米磁珠和结合液按比例配制成纳米磁珠结合液；

将制备好的纳米磁珠结合溶液加入样本中，震荡混匀后静置，并弃掉上清；

使用一次洗涤液清洗游离DNA；

使用二次洗涤工作液清洗游离DNA；所述二次洗涤工作液由二次洗涤液用无水乙醇稀释得到；

加入洗脱液，震荡以使纳米磁珠重悬，并进一步震荡以使纳米磁珠上的游离DNA洗脱。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述按照先添加蛋白酶K，然后添加样本，最后加入裂解液的顺序，依次添加各个组分，震荡混匀各组分，并孵育进行样品裂解的步骤中包括：

在15毫升的大离心管中依次添加质量浓度为20毫克/毫升的蛋白酶80微升、血浆样本4毫升和样本裂解液400微升；

震荡大离心管以混匀其中各组分，并将大离心管置于60℃环境中孵育20分钟；

孵育结束后，将大离心管平衡至室温。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将制备好的纳米磁珠结合溶液加入样本中，震荡混匀后静置，并弃掉上清的步骤中包括：

将制备好的纳米磁珠结合溶液加入大离心管的血浆样本中并震荡混匀；

摇晃离心管以促进游离DNA与纳米磁珠的结合；

将上述大离心管置于磁力架上静置至管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述使用一次洗涤液清洗游离DNA的步骤中包括：

将大离心管从所述磁力架上取下，加入1毫升洗涤液，并涡旋震荡以重悬纳米磁珠；

将已重悬的纳米磁珠溶液转移入一个1.5毫升离心管；

将所述1.5毫升离心管置于磁力架上至管内磁珠聚集于管壁；

利用1.5毫升离心管内的上清液来润洗所述大离心管的管壁和管盖，将残余磁珠的润洗液转移回所述1.5毫升离心管；

将所述1.5毫升离心管置于磁力架上静置至管内溶液澄清且磁珠聚于管壁；

弃掉上清；

将1.5毫升离心管从磁力架上取下，加入1毫升洗涤液并涡旋震荡该1.5毫升离心管30秒；

将1.5毫升离心管于台式离心机中快速离心，将粘壁的残液甩至管底，并将该离心管置于磁力架上静置至管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。