[发明专利]一种改变菊花香气成分萜烯类挥发物含量的方法

说明书

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转CmWRKY7基因改变切花菊萜烯类挥发物含量的方法，包括以下步骤：从茶用菊‘滁菊’中克隆CmWRKY7基因；构建CmWRKY7基因植物表达载体；采用农杆菌介导法将其转入菊花中，进行筛选培养初步获得抗性植株。对转化植株进行PCR、定量RT‑PCR检测证实CmWRKY7内源基因已经整合到转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行表型观察与统计分析，发现与未转基因植株相比，转基因植株的萜烯类挥发物含量改变。本发明通过转化内源CmWRKY7转录因子并正常转录表达，从而调控了萜烯生物合成，为利用基因工程技术提高切花菊芳香品质提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

技术领域

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转CmWRKY7基因改变菊花香气成分萜烯类挥发物含量的方法。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)起源于我国，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，产量居四大切花之首，在生产和园林应用中占有十分重要的地位，可做观赏、药用、食用等，具有很高的观赏和经济价值。

菊花挥发油主要为β-蒎烯、桉叶油醇、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯等化合物，上述化合物均为单萜或单萜衍生物(Zhang et al.,2010)。因此，萜类及其衍生物特别是单萜或单萜衍生物为菊花花香的主要成分，对其合成路径的调控能够影响菊花的花香。

WRKY是植物所特有的一类转录因子，是近年来新发现的新型锌指型转录调控因子。WRKY是一个庞大的转录因子家族，家族成员在结构上有共同的特点：每个成员都含有一个WRKY结构域，该结构域是由一段大约60个高度保守的氨基酸残基所组成的多肽序列。另外，WRKY转录因子的DNA结合域中一般都含有一个锌指结构(Rushton et al.,1996)。迄今，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中共克隆了74个WRKY成员(Eulgem,2005)，而水稻中则发现了105个完整的WRKY家族成员(Muthamilarasan et al.,2015)。WRKY转录因子参与植物多个信号传导途径的调控，如植物的生长发育、对生物胁迫和非生物胁迫的应激响应等，其表达具有快速、瞬时等特点(Wang et al.,2016,Ding et al.,2016,Tripathi et al.,2014,Wu et al.,2016)，同时还具有不同发育阶段与组织特异性表达特性(Tripathi etal.,2014)。通常情况下，WRKY转录因子的下游基因启动子序列中会出现多个W-box，WRKY蛋白可以特异地与之结合从而调节相关基因的表达，(Ciolkowski et al.,2008)。

研究表明，WRKY可以调控植物萜类物质的合成，不仅可以直接调控萜类合成酶基因的表达，而且可以参与萜类物质合成路径中的一系列基因的表达调控(Ma et al.,2009)。如棉花GaWRKY1可以调控杜松烯合成酶基因(GaCAD1-A)的表达(Xu et al.,2004)；长春花CrWRKY1可以调控萜类生物碱的合成(Suttipanta et al.,2011)；青蒿AaWRKY1不仅可以调控紫槐烯合酶基因(AaADS)的表达，还可以调节萜类合成路径中一系列基因的表达(Ma et al.,2009)。由于萜类代谢途径中一系列合成酶在转录水平上往往呈现出相关性，这些合成酶的表达可能受到同一个/类转录因子的调控。因此，WRKY转录因子家族基因很有可能也参与菊花萜类合成路径的调控。

参考文献：

Ciolkowski I,Wanke D,Birkenbihl R,Somssich I,2008.Studies on DNA-binding selectivity of WRKY transcription factors lend structural clues intoWRKY-domain function.Plant Molecular Biology68,81-92.