[发明专利]一种改变菊花香气成分萜烯类挥发物含量的方法在审
| 申请号： | 201910264318.3 | 申请日： | 2019-04-03 |
| 公开（公告）号： | CN109943573A | 公开（公告）日： | 2019-06-28 |
| 发明（设计）人： | 陈发棣;胡月姮;宋爱萍;管志勇;房伟民;张雪 | 申请（专利权）人： | 南京农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/29 | 分类号： | C12N15/29;C12N15/82;C12N15/66;C12Q1/6851;A01H5/00;A01H6/14 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司 32218 | 代理人： | 竞存;徐冬涛 |
| 地址： | 210043 江苏省南京市栖霞区八卦洲街道*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 转基因植株 挥发物 萜烯 菊花 转录 切花菊 基因工程技术 农杆菌介导法 生物技术育种 植物基因工程 转基因育种 基因组DNA 表达载体 基因改变 基因植物 抗性植株 内源基因 筛选培养 生物合成 有效推动 转化植株 转录因子 统计分析 表型 滁菊 构建 内源 整合 香气 克隆 转入 基因 调控 观察 转化 进程 发现 | ||
1.如SEQ ID NO.1所示的CmWRKY7基因在调控菊花香气成分萜烯类挥发物含量中的基因工程应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述CmWRKY7基因植物表达载体导入切花菊，降低菊花香气成分萜烯类挥发物含量；优选的，所述萜烯类为单萜和/或单萜衍生物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CmWRKY7基因植物表达载体的构建方法为：以茶用菊‘滁菊’的cDNA为模板，设计如SEQ ID NO.4所示的上游引物CmWRKY7-BamHI-F和SEQ ID NO.5所示的下游引物CmWRKY7-Not I-R，进行PCR反应，在目的基因CmWRKY7的上游和下游分别引入BamHI和NotI酶切位点；将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmWRKY7片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经Pvu I单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，得到CmWRKY7基因植物表达载体pMDC43-CmWRKY7。
4.一种通过转CmWRKY7基因改变菊花香气成分萜烯类挥发物含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)以茶用菊‘滁菊’为材料，提取总RNA，反转录获得cDNA；
(2)构建CmWRKY7基因植物表达载体：以步骤(1)获得的cDNA为模板，设计如SEQ IDNO.4所示的上游引物CmWRKY7-BamH I-F和SEQ ID NO.5所示的下游引物CmWRKY7-Not I-R，进行PCR反应，在目的基因CmWRKY7的上游和下游分别引入BamHI和NotI酶切位点；将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmWRKY7片段与BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经Pvu I单酶切线性化后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，得到CmWRKY7基因植物表达载体pMDC43-CmWRKY7；
(3)将步骤(2)构建得到的CmWRKY7基因植物表达载体加入感受态农杆菌EHA105，挑选阳性克隆，通过叶盘法转化菊花，将pMDC43-CmWRKY7导入菊花，对初步获得潮霉素抗性的转基因植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，验证内源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并表达，筛选阳性转CmWRKY7基因植株，即为改变菊花香气成分萜烯类挥发物含量的转基因菊花植株。
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