[发明专利]一种sgRNA、敲除载体、KLF4基因的敲除方法及其应用

说明书

本发明公开一种sgRNA、双链DNA、载体和细胞。本发明还公开了一种KLF4基因的敲除方法。本发明首次利用CRISPR/Cas9技术构建KLF4敲除的IPEC‑J2细胞系，可作为猪疾病研究的理想细胞模型；利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，比基因沉默、干扰等技术手段可更有效地敲除KLF4基因，更有助于KLF4蛋白的功能研究；基因测序检测表明KLF4基因序列被敲除，可造成KLF4基因功能的缺失，是较为理想的KLF4基因敲除的IPEC‑J2细胞模型。本发明的敲除方法简便，打靶效率高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及CRISPR/Cas9的应用技术，也涉及猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)基因敲除载体、基因敲除方法及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9技术是来源于细菌和古生菌中的一种由sgRNA(small guide RNA)介导的适应性免疫系统。其中sgRNA用于识别、结合靶点DNA，当Cas9蛋白活性被激活后可结合区域下游的DNA并对其进行切割，生成双链DNA断裂，诱发由非同源末端连接修复机制造成的移码突变，从而实现对靶基因的编辑。CRISPR/Cas9技术因其简便和高效的特性，近几年来作为真核基因进行定点编辑的重要遗传手段在人类及动植物基因功能研究领域得到广泛应用。

猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)分离自新生仔猪空肠中段的柱状上皮细胞，具有研究猪病原体感染的物种特异性，是研究猪多种疾病研究的理想体外模型，尤其在产肠毒素大肠杆菌和病毒性腹泻抗性基因功能鉴定研究中广泛应用。

KLF4为Kruppel样转录因子家族成员，参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程，并介导先天免疫反应。目前尚未有猪KLF4基因的敲除载体及KLF4基因敲除的小肠上皮细胞模型。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种sgRNA。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种双链DNA。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种载体或细胞。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种KLF4基因的敲除方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种sgRNA，所述sgRNA的碱基序列为ACAGCCATGTCAGACTCGCC。

本发明内容还包括一种双链DNA，所述双链DNA的上游序列为：

sgRNA3F：

双链DNA的下游序列为：

sgRNA3R：

本发明内容还包含所述的sgRNA或所述的双链DNA的载体，该载体是一种可打靶猪KLF4基因的CRISPR/Cas9敲除载体。

本发明内容还包含所述的载体的细胞。

本发明内容还包含一种KLF4基因的敲除方法，包括以下步骤：

1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：根据猪KLF4基因找出CDs区5’端进行敲除靶位点设计sgRNA向导序列；

2)打靶载体的构建：将设计的sgRNA向导序列退火形成双链DNA序列，然后与载体相连接得到连接产物，将连接产物导入大肠杆菌得到菌落，菌落提取质粒得到敲除载体，根据敲除载体及sgRNA序列设计PCR引物，对菌落PCR的产物进一步测序验证获得阳性打靶载体；

3)细胞转染：将阳性打靶载体加入处于对数生长期的IPEC-J2细胞的悬浮液中进行电转得到细胞液；