[发明专利]一种sgRNA、敲除载体、KLF4基因的敲除方法及其应用

权利要求书

1.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的碱基序列为ACAGCCATGTCAGACTCGCC。

2.一种双链DNA，其特征在于，所述双链DNA的上游序列为： sgRNA3F: 5’-CACCGACAGCCATGTCAGACTCGCC-3’， 双链DNA的下游序列为： sgRNA3R: 5’-AAACGGCGAGTCTGACATGGCTGT-3’。

3.包含权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的双链DNA的载体。

4.包含权利要求3所述的载体的细胞。

5.一种KLF4基因的敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）靶位点设计及sgRNA序列的合成：根据猪KLF4基因找出CDs区5’端进行敲除靶位点设计sgRNA向导序列；所述sgRNA向导序列为ACAGCCATGTCAGACTCGCC；

2）打靶载体的构建：将设计的sgRNA向导序列退火形成双链DNA序列，然后与载体相连接得到连接产物，将连接产物导入大肠杆菌得到菌落，菌落提取质粒得到敲除载体，根据敲除载体及sgRNA序列设计PCR引物，对菌落PCR的产物进一步测序验证获得阳性打靶载体；

3）细胞转染：将阳性打靶载体加入处于对数生长期的IPEC-J2细胞的悬浮液中进行电转得到细胞液；

4）KLF4基因的敲除：将嘌呤霉素对细胞液进行药物筛选，将获得的单克隆细胞转移扩大培养，当细胞长满时，分离出部分细胞并提取其基因组DNA，根据KLF4基因全序列，在敲除靶位点附近设计高特异性的引物，然后对提取的基因组DNA进行PCR扩增得到PCR产物，对产物进行验证即可。

6.根据权利要求5所述的KLF4基因的敲除方法，其特征在于，所述步骤2）中的PCR引物为：F3：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’； R3：5’-GGCGAGTCTGACATGGCTGT-3’。

7.根据权利要求5所述的KLF4基因的敲除方法，其特征在于，所述步骤2）中菌落PCR的反应程序为95℃ 10 min；95℃ 35 sec，60℃ 35 sec，72℃ 35 sec，35个循环；72℃10min。

8.根据权利要求5所述的KLF4基因的敲除方法，其特征在于，所述步骤3）中IPEC-J2细胞浓度为1~2×106个/ml。

9.根据权利要求5所述的KLF4基因的敲除方法，其特征在于，所述步骤4）高特异性的引物序列为： F: 5’-GGACTTCGGAGGACCTCTGA-3’； R: 5’-CCACCCACAGAAGCCCACTA-3’。

10.根据权利要求5所述的KLF4基因的敲除方法，其特征在于，所述步骤4）PCR反应程序为95℃ 5 min；95℃ 10 sec，60℃ 10 sec，72℃ 10 sec，35个循环；72℃ 5 min。