[发明专利]一种新型环状三元适配体及其合成方法和应用

说明书

本发明提供一种新型环状三元适配体，三条适配体单链携带有相互互补的碱基序列，三条适配体单链通过各自携带的部分互补碱基彼此配对后连接形成环状，三条适配体单链为同一种或多种适配体单链。本发明还公开上述新型环状三元适配体的合成方法，包括以下步骤：S1、根据所需要标记识别的抗原，选择与抗原匹配的三条适配体单链；S2、在目标适配体单链中引入特定碱基序列，使第一适配体单链和第二适配体单链上分别带上与第三适配体互补的碱基序列；S3、在DNA连接酶缓冲液中加入等量的三种适配体单链，退火；降温后，加入DNA连接酶进行不低于1h的反应，获得新型环状三元适配体。本发明提供一种高稳定性、高特异识别性的新型适配体，可用于肿瘤的诊断与治疗。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种新型环状三元适配体及其合成方法和应用。

背景技术

由于对少量肿瘤细胞往往难以追踪和清除，早期癌症难以查出，等到中晚期 确诊时，已错过最佳治疗时间。手术虽然可以切除99％的恶性肿瘤，但仍然会有 少部分浸润在组织中的肿瘤细胞难以去除。留存的少部分肿瘤细胞会通过原发肿 瘤部位最终进入到血液与淋巴组织中，形成循环肿瘤细胞(CTCs)，而CTCs的存 在是导致癌症转移复发的根源。不管是早期产生的肿瘤细胞还是术后存留的肿瘤 细胞，如果能够做到及时监测、及时治疗，将大大减轻患者精神和经济上的痛苦。

目前我国临床使用的检测手段一般集中在传统影像学诊查，如CT、MIR、超声波诊断等， 一般产生一定大小的实体瘤才能被检测出来。而对于血液中少量的循环肿瘤细胞，目前大致 有三种检测方法，第一种是Veridex公司的Cellsearch CTCs检测系统，也是FDA唯一批准用 于检测CTCs的装置，利用铁磁流抗体与CTC表面的特异性抗原结合，在磁场下进行分离后染 色。第二种是Celsee Diagnostics公司生产的Celsee PREP检测系统，该系统利用肿瘤细胞的物 理特性来进行检测。第三种是Abnova推出的CytoQμestTM，以分子亲和力为基础，利用对 温度敏感的奈米柱阵列捕捉及释放CTCs。然而以上三种技术都比较昂贵，且缺乏CTC的体内 示踪以及杀伤功能。

核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从体外筛选获得，通常是一 种短链寡核苷酸，能折叠成独特的三维结构，能特异性识别靶标。核酸适配体具有许多优点： 任何特定靶点的适配体可经体外试验筛选，克服了传统抗体需从动物中获取的局限性；筛选 的适配体无免疫原性；可重复合成且纯度高；适配体很容易用荧光素、纳米粒子和酶类等修 饰；热变性后仍能恢复活性构象，成本较低且易于运输。由于肿瘤细胞表面往往恶性表达某 些抗原，现已有多种适配体被筛选出能够特异性与肿瘤细胞结合，如Sgc8可以特异性识别酪 氨酸激酶7，HB5可以特异性识别Her2，SYL3C可以特异性识别Epcam。当适配体上修饰荧光 分子后，可以实现体内肿瘤细胞示踪，可以成为早期以及术后的肿瘤细胞检测的一种手段。 同时，适配体易修饰，可以在适配体上接载药物，在靶向肿瘤细胞后能够进一步将其杀死， 达到诊疗一体化的目的。

现有的适配体为核酸单链，由于磷酸二酯键不稳定，易被血清中的核酸内切酶切割而丧 失功能，所以保证其生物稳定性是使用的前提。肿瘤细胞表面往往高表达一种或多种抗原， 现有技术中的核酸单链适配体只能识别肿瘤细胞表面的单个抗原，识别和标记效率较低。因 此，现在需要研发出一种稳定性高、不易被血清中核酸内切酶切割而失效，且能够识别肿瘤 细胞表面多个抗原、识别效率高的新型适配体分子，以提供更有效、价格较低的肿瘤的诊断 与治疗手段。

发明内容：

本发明目的是提供了一种高稳定性，高特异识别性的新型新型环状三元适配体及其合成 方法和应用，要解决现有技术中单个适配体用于肿瘤细胞诊断时所存在的稳定性差、识别效 率低等技术问题，以用于肿瘤的诊断与治疗，提供效率更高、成本更低的诊治技术。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：