[发明专利]一种高纯度DNA模板的制备方法

说明书

本发明公开了一种高纯度DNA模板的制备方法，其技术方案是：将培养的菌株置于加入无菌去离子水的PCR管中形成混合菌液，将混合菌液置于PCR仪中高温裂解，后降温冷却；然后在离心机上经12000‑15000rpm离心，吸取上清液，弃除沉淀物，即获得高纯度DNA模板；依据需求将获得的高纯度DNA模板直接或经稀释后加入PCR体系进行PCR扩增。本发明降低了对后续扩增体系、特别是DNA聚合酶活性的影响，菌体高温裂解后再将裂解物冷却，可以使DNA重新快速形成螺旋，获得的DNA模板纯度高、数量多，DNA模板约占混合菌液量的67%‑72%，对后续PCR扩增过程中DNA聚合酶的影响较小，极大的提高了扩增效率，减少了非特异性扩增，制备的DNA模板稳定，克服了现有DNA模板制备方法存在的缺陷。

技术领域

本发明涉及一种微生物PCR实验的DNA模板制作，具体是一种高纯度DNA模板的制备方法，属于微生物领域。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种广泛用于生命科学领域的分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段，而DNA模板的制作是PCR实验的首要步骤。目前用于制作DNA模板的方法主要包括试剂盒提取法；蛋白酶K消化裂解法；碱变性法；微波法和煮沸法等，但这些方法在使用过程中都存在一定的缺点。试剂盒提取法需要购买商品化试剂盒，提取过程需要使用冰浴等，操作要求高，程序复杂，耗时长，成本高，且不同试剂盒提取的模板质量不同；蛋白酶K消化裂解法属于酶解法的一种，适用于所有样本的消化处理，但所需的各类溶液配制相当繁琐，消化处理后杂质较多，需要配合有机试剂抽提或离心去除杂质提高纯度，同时蛋白酶K本身就是一种蛋白杂质，经过消化处理的样品还需高温灭活蛋白酶K，操作步骤多，耗时长，技术要求较高，有机试剂的使用对操作者危害较大；碱变性法是化学方法的一种，多用于从细胞中提取DNA，提取时将样品置于强碱性环境中使其裂解，并使所释放的DNA变性，随后用酸性溶液中和至中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA由于分子巨大难以复性，经过离心，质粒DNA位于上清液，基因组DNA会和裂解的菌体一起沉淀至底部，虽特异性强，但还需将所提基因组DNA进一步分离，耗时耗力，且无法保证强碱环境是否对微生物基因序列造成影响；微波法多用于真菌DNA的提取，利用微波处理破碎样品，使蛋白变性，进而使用苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等方法得到基因组DNA，提取步骤繁琐，成本较高；煮沸法多用于细菌DNA的提取，通过高温使细胞裂解、DNA解链、蛋白质变性，温度下降后DNA重新形成超螺旋分子，通过离心去除蛋白质等杂质，获得基因组DNA，虽较为简便且适合细菌模板制备，但操作过程需要的菌悬液体积及菌量较大，经过高温处理后释放的细胞裂解物及模板中的杂质较多，无法得到质量较好的模板，另外在加热煮沸过程中经常会因离心管压力过大而出现管盖自行崩开的现象，导致管内菌液飞溅，容易造成污染。由此可见，现有DNA模板制备方法均存在一定的局限性，是一种较为理想的DNA模板的制备方法。

发明内容

本发明为克服现有DNA模板制作中存在的技术问题，而公开一种高纯度DNA模板的制备方法。

本发明的技术方案如下：

a.向灭菌的PCR管中加入无菌去离子水，标号注明，另备用同样容积灭菌的PCR管，标号注明；

b.将培养的菌株置于加有无菌去离子水的PCR管中形成混合菌液，混合菌液的浊度为0.1-0.2MCF（麦氏浊度）；

c.将装有混合菌液的PCR管置于PCR仪中，在99-100℃温度下裂解10min，后降温至4℃冷却；

d.完成裂解后将PCR管置于冰水中水浴或在4℃冰箱内稳定3-5min， 然后在离心机上经12000-15000rpm离心2-3min，吸取上清液置于备用的PCR管中，弃除沉淀物，即获得高纯度DNA模板，保存于-40℃冰箱内；

e．在使用时，依据需求将获得的高纯度DNA模板直接或经稀释后加入PCR体系进行PCR扩增。