[发明专利]一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法

说明书

本发明公开了一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法，采用胰蛋白酶对母乳进行酶解，选择母乳中抗体酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得母乳中抗体的含量。本发明能同时定量检测母乳中三种抗体含量，稳定性好、定量准确、重复性好、特异性高。

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，特别涉及一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法。

背景技术

母乳中的抗体在婴儿的成长与发育中起到了非常重要的作用。由于新生儿的免疫系统还未发育完全，因此母乳中的抗体可以帮助新生儿抵御外环境带来的侵害，帮助婴儿免疫力的提高。通常情况下人体中总共可以分泌5中抗体，分别是IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中，IgD、IgE所占人体总抗体的比例很小。通常情况下，婴儿可以从母乳中获得IgG、IgA、IgM这三种重要的抗体。

准确而有效的测量人奶中的抗体含量，可以帮助对新生儿的正确喂养，有效预防潜在疾病的发生，提高婴儿的生存质量。传统方法对人奶中抗体检测是以酶联免疫吸附测定法为代表的抗原抗体检测方法。但是，由于人奶中基质干扰和抗体的交叉反应，此方法测结果的稳定性及准确度常常受到影响。因此，现在急需一套新的方法，使其能够准确的对母乳中的主要抗体物质进行定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法，包括如下步骤：

(1)样品预处理

母乳样品混合人工合成的同位素标记特异性多肽混标，并经胰蛋白酶酶解后得预处理液；同位素标记特异性多肽混标为同位素标记IgA特异性多肽、同位素标记IgG特异性多肽及同位素标记IgM特异性多肽的混合物；同位素标记特异性多肽混标中各同位素标记特异性多肽的浓度均为20μg/mL；

IgA特异性多肽序列为：SAVQGPPER；

IgG特异性多肽序列为：VVSVLTVLHQDWLNGK；

IgM特异性多肽序列为：QIQVSWLR；

同位素标记IgA特异性多肽序列为：SAV*QGPPER；

同位素标记IgG特异性多肽序列为：V*VSVLTVLHQDWLNGK；

同位素标记IgM特异性多肽序列为：QIQV*SWLR

V*代表同位素标记缬氨酸；

(2)标准曲线制作

取梯度浓度的人工合成的特异性多肽混标各10μL，分别加入人工合成的同位素标记特异性多肽混标10μL及980μL水；通过0.22μm滤膜后上高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，同时获得IgA抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgA抗体标准品溶液浓度的标准曲线、IgG抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgG抗体标准品溶液浓度的标准曲线、IgM抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgM抗体标准品溶液浓度的标准曲线；

(3)色谱串联质谱分析

预处理液通过0.22μm滤膜后上高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，得到的结果代入标准曲线，从而获得母乳样品中IgA特异性多肽、IgG特异性多肽、及IgM特异性多肽的浓度；母乳样品中IgA抗体浓度＝样品中IgA特异性多肽的摩尔浓度×IgA抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数(50)/2，