[发明专利]一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法

权利要求书

1.一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品预处理

母乳样品混合人工合成的同位素标记特异性多肽混标，并经胰蛋白酶酶解后得预处理液；

同位素标记特异性多肽混标为同位素标记IgA特异性多肽、同位素标记IgG特异性多肽及同位素标记IgM特异性多肽的混合物；同位素标记特异性多肽混标中各同位素标记特异性多肽的浓度均为20μg/mL；

IgA特异性多肽序列为：SAVQGPPER；

IgG特异性多肽序列为：VVSVLTVLHQDWLNGK；

IgM特异性多肽序列为：QIQVSWLR；

同位素标记IgA特异性多肽序列为：SAV*QGPPER；

同位素标记IgG特异性多肽序列为：V*VSVLTVLHQDWLNGK；

同位素标记IgM特异性多肽序列为：QIQV*SWLR；

V*代表同位素标记缬氨酸；

(2)标准曲线制作

取梯度浓度的人工合成的特异性多肽混标各10μL，分别加入人工合成的同位素标记特异性多肽混标10μL及980μL水；通过0.22μm滤膜后上高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，同时获得IgA抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgA抗体标准品溶液浓度的标准曲线、IgG抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgG抗体标准品溶液浓度的标准曲线、IgM抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgM抗体标准品溶液浓度的标准曲线；

(3)色谱串联质谱分析

预处理液通过0.22μm滤膜后上高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，得到的结果代入标准曲线，从而获得母乳样品中IgA特异性多肽、IgG特异性多肽、及IgM特异性多肽的浓度；母乳样品中IgA抗体浓度＝样品中IgA特异性多肽的摩尔浓度×IgA抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数/2，

母乳样品中IgG抗体浓度＝样品中IgG特异性多肽的摩尔浓度×IgG抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数/2

母乳样品中IgM抗体浓度＝样品中IgM特异性多肽的摩尔浓度×IgM抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数/2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，母乳样品混合人工合成的同位素标记特异性多肽混标，并经胰蛋白酶酶解后得预处理液得具体操作为：取母乳样品20μL，加入碳酸氢铵溶液890μL，加入人工合成的同位素标记特异性多肽混标10μL，加入二硫苏糖醇10μL，50℃反应30分钟，再加入碘代乙酰胺30μL暗处反应30分钟，加入胰蛋白酶20μL，37℃反应2小时，反应完毕后加入10％甲酸20μl终止反应，得预处理液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：碳酸氢铵溶液浓度为0.1mol/L，二硫苏糖醇浓度为100mmol/L，碘代乙酰胺浓度为100mmol/L，胰蛋白酶浓度为250ug/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，梯度浓度的人工合成的特异性多肽混标的梯度浓度设置为：1ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，75ng/ml，100ng/ml，250ng/ml，400ng/ml，650ng/m，1000ng/ml，1500ng/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱，柱温为40℃；流动相A为体积百分比为0.1％的甲酸的乙腈溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min；

其中，梯度洗脱为：流动相A的体积百分比由3％耗时10min上升至40％，对应地流动相B的体积百分比由97％耗时10min下降至60％，然后改为100％流动相A冲洗2min，最后改为流动相A体积百分比3％和流动相B体积百分比97％保留3min。