[发明专利]用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的培养基

说明书

本发明提供用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的增殖培养基以及分化培养基，该增殖培养基和分化培养基以用于哺乳动物细胞生长的培养基为基础培养基，添加有补充L‑谷氨酰胺的试剂、维持培养基pH值稳定的pH值调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物、N‑乙酰半胱氨酸和任选的烟酰胺，以及添加有BMP抑制剂、Wnt激动剂、生长因子、Rock信号通路抑制剂、P38信号通路抑制剂、Notch信号通路抑制剂、地塞米松、BMP7和cAMP激活剂中的一种或任意多种。利用本发明的培养基培养肝脏细胞可获得有功能的肝脏类器官。

技术领域

本发明涉及肝脏细胞的培养及类器官的建立，具体而言，本发明涉及用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的培养基。

背景技术

肝脏是人体最大的解毒器官，也是人体内最大的消化腺，同时也是机体物质能量代谢的中心。肝脏主要由两种上皮细胞组成，分别是肝细胞和胆管细胞。肝脏的主要功能包括：储存肝糖原，合成基本的分泌性蛋白，清除外源化合物，调控机体代谢，转运药物以及排泄胆汁等。正是由于肝脏具有重要的生理功能，很多与肝脏有关的疾病，如肝炎、肝癌、肝纤维化、肝硬化、急慢性肝衰竭等，均有较高的发病率和死亡率。中国是肝炎感染的高发国家，因此重症肝脏疾病在中国的发病率也非常高。肝脏移植仍然是重症肝脏疾病治疗最有效的手段。由于肝脏供体的匮乏，很多重症肝脏疾病患者最终在保守治疗中死去，因此亟待需要发展新的治疗手段来提高肝病治疗的存活率。如果能将一个肝脏供体的细胞分离并移植给多个病人，可以大大节省肝源，使更多病人获得治疗机会。肝细胞的移植治疗在动物模型中已经进行了数十年的研究，并且研究结果显示肝细胞移植可以显著改善肝损伤动物的肝功能和个体存活率。人胚胎肝细胞或成体肝实质细胞移植可显著提高急性肝衰竭病人的存活率，并已被用于延长急性肝衰竭病人的生命。因此肝细胞移植治疗是未来治疗重症肝脏疾病的趋势。尽管肝细胞在体内具有强大的再生能力，但是在体外成熟肝细胞的长时间培养仍然是一个世界性难题。

体外肝细胞培养主要采用三种策略：一是肝脏细胞的体外直接培养，二是通过干细胞的体外肝细胞定向分化培养，三是通过诱导纤维祖细胞转分化为类肝细胞培养。成熟肝细胞的培养一直是世界性难题，近期的研究表明，成熟肝细胞仅仅可以在体外维持一周左右的扩增培养。尽管胆管细胞可以在体外长期培养，但是其在诱导转分化为肝细胞以后仅能有限地恢复肝损伤动物的肝功能。利用人类胚胎干细胞（hES）和诱导多潜能性干细胞（hiPS）的体外分化技术，可以诱导干细胞分化成具有肝细胞标记物和部分肝细胞功能的“类肝细胞”。通过体外化学诱导或者转染肝细胞特异性的转录因子，可以诱导成纤维细胞转分化为具有部分肝细胞功能的肝细胞。然而近期的研究显示，这种体外的重编程将可能导致遗传和表观遗传改变，诱导产生基因组不稳定性和基因突变，将转基因生物材料移植入人体将面临很大的伦理学问题，这些缺陷将导致hES和hiPS来源的“类肝细胞”细胞移植具有巨大的风险。目前迫切需要建立一套可控的肝脏细胞培养新技术体系，在体外培养出具有肝组织器官功能的正常成熟肝细胞。

类器官（Organoid）研究是极重要的前沿性热点领域，是一种最新的细胞体外培养技术，即由干细胞定向诱导分化细胞、正常组织细胞或者病人发病组织细胞培养而形成的三维体外组织培养技术。类器官模型能够很好地模拟细胞在体内的微环境，对在体外构建具有生理功能的研究模型具有得天独厚的优势。目前，利用类器官培养已经在体外成功构建了结肠、胃、前列腺和胰腺等组织类器官。尽管类器官培养研究仍处于相对起步阶段，但是其作为一种重要的研究技术已经开始被广泛应用于干细胞和肿瘤的研究。类器官具有以下主要优点：(1)维持了组织器官细胞的高度复杂性；(2)维持了功能细胞与微环境基质的接触极性，更好地模拟了体内微环境；(3)来源于临床组织的类器官培养效率高，耗时少，可进行细胞的长期培养；(4)同时具备了可进行遗传操作的优点和模型的三维复杂特性。最新的研究表明，类器官可以快速准确地预测抗癌药物的疗效。类器官技术被Nature Methods评价为2017年生命科学领域最具潜力的年度技术。类器官模型将在疾病模型构建、器官移植、药物筛选、药物安全性测试和药物疗效评价等领域发挥巨大的应用价值。

发明内容